Способ очистки соединений инсулина

 

Иностранцы

Ричард Ли Джексон и Джон Джордж Стилц (США) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма ли Лиллн энд Компани (CIOA) P3) Заявитель (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ СОЕДИНЕНИИ ИНСУЛИНА изобретение относится к улучшен- ному способу очистки соединений инсулина со щелочными металлами или с аммонием путем гель-фильтраций.

Известен способ очистки инсулина путем дифференцированного высаливания (1), по которому инсулин вйсаливают из нейтрализованного экстрак« та добавлением хлористого натрия, Неудобство метода состоит в том, что для получения более полного выхода продукта высаливание необходи.".о повторять многократно.

Другой способ очистки инсулина, имеющий промышленное значение,состоит15 в осаждении или кристаллизации инсулина из растворов в виде комплексов ,с цинком. Причем соединение цинка. с инсулином осаждают из буферного водного раствора, например из буфера, содержащего лимонную кислоту и цитрат f 21, Получаемые таким образом цинк-. инсулиновые комплексы содержат небольшие количества белков неинсулинового характера, главным образом проинсулина и проинсулиноподобного белк а, Хотя такие компоненты содержатся в незначительных количествах (менее

1 Ъ

8 вес ° %), однако они имеют антигенный или имунногенный характер (3 1.

Известен также способ очистки препарата инсулина в виде раствора соединений инсулина с щелочным метал лом или аммонием, по которому применяют гель-фильтрации на сефадексе

6 -50 Йяе с использованием в качестве элюента 0,01М соляной кислоты при комнатной температуре (4).

Несмотря на удобства и простоту, этот способ имеет существенный недостаток: более полная очистка продукта от проинсулиновых компонентов достигается повторной гель-фильтрацией, Многократная очистка снижает выход целевого продукта.

Цель изобретения состоит в повыше;.,ли качества, в увеличении выхода продукта и s упрощении процесса очистки инсулина.

Поставленная цель достигается описываемым способом очистки соединений инсулина с щелочным металлом или аммоннем путем гель-фильтрации водного раствора указанного соединения при комнатной температуре, заключающимся в том, что используют набухший гель, поглощающий в сухом состоянии 4,5-5,5% воды,с частицами

Формула изобретения

1. Способ очистки соединений инсулина с щелочным металлом или аммонием путем гель- фильтраций водного раствора указанного соединения при комнатной температуре, о т л и ч а ю щ и и с -я тем; что; с целью улучшения качества и увеличения выхода продукта, используют набухший гель, поглощАющий в сухом состоянии 4,5-5,5% воды с частицами диаметром от 20 до 80 мкм, который помещают в качестве насадки

8 колонку, в последнюю добавляет указанный вйше раствор инсулина чистотой

80Ъ с концентрацией инсулина от 1 до

8 вес. Ъ на объем и общим количеством инсулина от 0,8 до 6,7 г/л слоя и рН от 7,5 до 9,5, и проводят элюирование водйым элюентом, содержащим основания, при рН, соответствующем значению рН раствора инсулина.

2. Способ по п.l о т л и ч а юшийся тем, что, в качестве геля используют сшитый декстран.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют раствор с общим количеством инсулина от

3,5 до 5 г/л объема слоя.

4. Способ по пп. 1,2, о т л и ч а юшийся - тем, что используют вод- . ный раствор с общим количеством ин.сулина 4,5 г/л объема. слоя.

5. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют элюент, .содержащий неорганическую соль в концентрации от 0,01 до 0,02М, 6. Способ по пп.1,5, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве неорганической соли используют хлористый натрий,.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент С2А 92449076 кл,260-112,,7, 1948.

2.Патент США 92626228,кл.260-112".7, 1956.

3. КЕ. бтпсе, R.М. ЕПгб, М%. Hromer Krcino РГПП6и(1П ГCharaCterlZatian and Amina acid 5equer»са, gcience, »GAL, !65 (968).

9, 1.С. landon,Coturnn Зог Large-8cate get Ftt-

tration on Pdroup gels. Fractionation vf Hope seed Proteins and f nsu tin „Х.At»r, Feed сЬетл. Й7(, t9t4) 58/.

Тираж 671 Подписное ужгород, ул. Проектная, 4. ф д., .д 66711 диаметром от 20 до 80 мкм," которйй пбйй»гают в качестве насадки в колонicy в последнюю добавляют укаэанный выше раствор инсулина чистотой 80% "с концентрацией ийсулина от 1 до

8 вес.Ъ на объем и общим количеством инсулина от 0,8 до 6,7 г/л слоя и рА от 7,5 до 9,5, и проводят элюирова Йие водным элюентом, содержащим основания, при рН, соответствующем значению рН раствора инсулина при комнатной температуре. . 10

Отличительными признаками способа

" " являются: использование в качестве насадки набухшего геля, .поглощающе-. го в сухом состоянии 4,5-5,5% воды, с .частицами диаметром от 20 до 15

80 Мкм, использование раствора йн- сулина чистотой 80% с концентрацией инсулийа от 1 до 8 вес .Ъ на объем

-и общим количеством инсулина от 0,8 до 6,7 г/л слоя и рН от 7,5 до 9,5

-и"проведение элюирования водным элюентом, содержащим основания, при рН, соответствующем значению рН раствора инсулина.

Предпочтительным вариантом способа являются использование в качестве геля сшитого декстрана водного раствора инсулина с общим количест-. " Вом "инсулина от 3,5 до 5 г/л объема слоя ; загрузка колонки водным раст-. вором инсулина составляет примерно

4,5 г/л объема слоя, применение в

-" качестве элюента раствора, содержа" щего -неорганическую соль в концентрации от 0,01 до 0,02 М, и, наконец, иснользбвание в качестве неорганической соли хлористого натрия.

Пример 1. Натриевое соединение бычьего инсулина (5,53 г) с силой действия 26,4 ед/мг и с содержанием проинсулина 7,2 вес.Ъ сусйендируют s дистиллированной воде, добавляют разбавленный раствор гидроокиси натрия до рН 9"О.

Объем полученного раствора составляет. 100 мл. Гель из сшитого декст- 45

-"рина с содержанием воды 5% и с частицами размерами DT 20 до 80 мкм, помещают в водный раствор гидроокиси

" натрия, значение рй которого 9,0.

Объем 4,0х43,0 см составляет 540 мл.

В колонку вводят по 40 мл раствора инсулина, Затем колонку элюируют водным раствором гидроокиси натрия при рН 9,0 и собирают фракции объемом примерно 6,5 мл, За ходом элюирования следят при помощи спектроскоггйи при длине волны 280 нм. Фракции, содержащие инсулин, объединяют-, подкисляют до рН 3,0 6 н.раствором соляной кислоты. Полученный раствор фильтруют, добавляют хлористый цинк, 60 и выделяют цинк-инсулин при рН 6,0 из ацетатноаммониевого буфера. Выход цинк-инсулина 1,83 r .что соответстЦНИИПИ Заказ 3216/47

Филиал ППП Патент, г.

1 4 вует выходу 82,5% от исходного материала. Сила действия инсулина составляет 26,8 ед/мг, а содержание проинсулина менее 0,05 вес.Ъ;извлечение,рассчитанное на единицу действия, 83,8%, 37,5 мл исходного раствора инсулина превращают непосредственно в цинк-инсулин по методике, описанной выше, без фильтрования через гель, Извлечение цинк-инсулина 1,87 г (90,1Ъ) прн содержании проинсулина

5,4 вес.%.