Способ очистки 5 -экзонуклеазы actinomyces coelicolor от фосфомоноэстеразы
Сеоз Соаетскик
Соцнеюктическмк
Республик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИ ВТННвСТВУ
С 07 G 7/028
С 12 0 13/10 т
С 07 H 19/00
Госукарственнмй комитет
СССР по дмам нзобретеняй к открмтий (23) ПриоритетОпубликовано 300431. Бюллетень М16
Дата опубликования описания 30.04.81 (53) УДК 577.15. 07 (088.8) Т.В.Шахова, Г.И.Хомякова, С.П.Воротило, С.A.Koíîâàëoâ и В.И.Максимов (72) Авторы (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ 5 -ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ ACT I NOHYCES
COELIC0LOR 0Т ФОСФОМОНОЭСТЕРАЗЫ
Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано при получении 5-экзонуклеазы, не содержащей примесей фосфомоноэстеразы. 5 -экзонуклеазу используют для получения 5 -нуклеотидов путем гидролиза нуклеиновых кислот. Примесь фосфомоноэстеразы вызывает практичес- 1О, I ки исчезновение 5 -нуклеотидов из реакционной смеси за счет дальнейшего превращения их в нуклеозиды.
Известен способ очистки 5 -экзонуклеазы из Actinomyces сое!ico1ог шт.А-5 зт фосфомоноэстеразы.Очистка 15 целевого фермента включает хроматографию на сефадексе G-75,диэтиламиноэтилсефадексе A-50, диализ, после чего полученный ферментный раствор прогревают в присутствии 2-меркаптоэта- Ю иола при 37 С и рН 5,5 в течение 4090 мин. Далее проводят фракционирование, т.е. разделение ферментов хроматографией на колонке с ДЭАЭ-сефадексом А-50.
2-Меркаптоэтанол, добавляемый при прогреве ферментного раствора, играет роль стабилизирующей добавки для экзонуклеазы, вызывая в то же время резкое уменьшение стабильности фосфомоноэстеразы.
Соотношение 5 -экзонуклеаза /фосфомоноэстераза после ф акционирования составляет 10000 (11..
Недостатком известного способа является многостадийность, а также наличие примесей фосфомоноэстеразы в целевом продукте. Кроме того, данный способ может быть реализован только в лабораторных условиях вследствие большого числа трудноосуществимых хроматографических операций.
Цель изобретения — упрощение технологической схемы процесса и улучшение качества получаемого продукта, т.е. более полная очистка от фосфомоноэатеразы. указанная цель достигается способом очистки 5 -экзонуклеазы Actinomyces coel i со1о r or фосфомоноэстеразы, который заключается в прогревании ферментного раствора в присутствии стабилизирующих добавок — сульфата аммония и PHK при 45 — 50 C в течение о
49-90 мин и двухстаднйном фракционироваиии ацетоном соответственно 0,5 и 2,0 объемами по отношеннк> к объему., исходного раствора с отделением пос825540 ле первой стадии осадка фосфомоноэстеразы.
В способе предпочтительно используют 5 -экзонуклеазу Actinomyces coe1
1 1 со 1 о г шт. А-18, причем обычно в виде. 4-6%-ного раствора в 0,005 N трис-НС1 буфере, содержащем 10 И9С1, Сульфат аммония обычно используют
В количестве 8-11% от насыщения, а рибонуклеиновую кислоту — 0,9-1%.
Способ осуществляют следующим образом.
Штамм-продуцент Act. coeiicolor выращивают на подходящей питательной срере при 30 С в течение 48 ч, фильтруют и из охлажденного раствора осаждают неочищенный фермент 5 -экзонуклеазу при добавлении 2,5 объемов ацетона.
Соотношение единиц 5 -экзонуклеазной и фосфомоноэстеразной активностей находится в пределах 10 — 100.
Для очистки от фосфомоноэстеразы препарат растворяют в буфере рН 6,6, к раствору добавляют РНК (на одну весовую часть фермента 0,2 вес.ч. PHK) и сульфат аммония в количестве 57 г/л, т.е. 10% от насыщения. Смесь имеет рН 4,7, ее нагревают до 50 С и выдерживают 40-90 мин, затем охлаждают и
I определяют соотношение 5 -экзонуклеазиой и фосфомоноэстеразной активностей. Установлено, что оно находится в пределах 2000-10000. К раствору .добавляют 0,5 объема ацетона и центрифугируют, из супернатанта осаждают
5 -экзонуклеазу добавлением еще 2,0 объемов ацетона. Осадок фермента высушивают. Выход 5 -экзонуклеазы составляет 45-50% от неочищенного препарата. Фосфомоноэстеразная активность не проявляется при инкубации фермента с субстратом в течение 3-х ч и десятикратной концентрации фермента в инкубационной смеси.
В опытах по гидролизу РНК с анализом продуктов гидролиза методом тонкослойной хроматографии обнаруживаются только нуклеотиды, а нуклеозиды полностью отсутствуют.
Следовательно, очищенный ферментный препарат пригоден для получения нуклеотидов из нуклеиновых кислот.
Предлагаемый способ основывается .на том, что при тепловом воздействии происходит денатурация, главным образом фосфомоноэстеразы, за счет чего и .происходит очистка 5 -экзонуклеазы от этой примеси. Обнаружено, что добавление рибонуклеиновой кислоты и сульфата аммония приводит к избираl тельной стабилизации 5 -экзонуклеазы, благодаря чему фермент выдерживает о более высокую температуру (до 50 С) в сравнении с известным способом
{37 С). Кроме того, согласно известному способу, 5 -экзонуклеаза неус( тойчива при рН ниже 5,0. В предлагаемом способе предпочтительно применяется рН ниже 5,0, так как 5 -экзонуклеаза в присутствии добавок (РНК и (МН ) SO4 ) стабильна в этих условиях, а фосфомоноэстераза, наоборот, инактивируется тем сильнее, чем ниже рН (см. таблицу). рН Инактивация, % сl
Фосфомоноэстеразы 5 -экзонуклеазы
45,7
49,5
65,5
6,0
38,5
5,5
38,5
5,0
t$
4,7
91
Из данных таблицы видно, что прогревание ферментного раствора при
Щ рН 4,7 приводит к инактивации фосфомоноэстеразы на 91%, а 5 -экзонуклеазы всего на 37%. с
Дальнейшая очистка 5 -экзонуклеазы от остаточной фосфомоноэстеразы достигается осаждением органическим растворителем. Фракция, осаждаемая 0,5 объе-. мом ацетона, содержит всю фосфомоно- эстеразную активность и лишь 5-10 %
5 -экзонуклеазы. Вторая фракция,осаждаемая после дополнительного введения ь двух объемов ацетона, содержит 5 -экзонуклеазу, свободную от примесей фосВфомоноэстеразы.
Пример . Выращивают Act, c,oe-! i color штамм А-18 в ферментере емкостью
1 м > при 30 С в течение 48 ч на питательной среде, содержащей пшеничную муку, обработанную (.-амилазой, осахаренный крахмал, и соли. 11ицелий отделяют от культуральной жидкости фильт40 рованием на фильтрперлите, фермент содержится в фильтрате. К фильтру добавляют Н9С1 до конечной концентрации 5 ° 10 м и 2 М НС1 до рН 5,5.
Раствор охлаждают до 4 С и к нему добавляют 2,5 объема охлажденного до
4 С ацетона. Выпавший осадок через
15 мин отделяют сепарированием (4 000 об/мин) и высушивают в вакууме. Соот I ношение 5 -экзонуклеазной и фосфомоноэстеразной активности составляет
90. Выход препарата 8,7 г/л культуральной, жидкости.
10 г этого препарата растворяют в
200 мл 0,005 И трис -НС1 буфера рН
6,65, содержащего 1 10 И И9С1у .
Нерастворившийся осадок отделяют центрифугированием 3000 об/мин и отбрасывают. К 180 мл раствора добавляют
1,8 г РНК, перемешивают до полного растворения, добавляют еще 10,25 г
Щ (НН4) 825540 Составитель О.Скородумова Редактор H.Êóçíåöîâà Техред Н. Граб Корректор М.Демчик Заказ 2559/81 Тираж 397 ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий ° 113035, Москва, Ж-35; Раушская наб., д. 4/5 Подписное Филиал ППП "Патент", r. Ужгород,.ул. Проектная, 4 отделяют выпавший осадок центрифугированием, а к раствору повторно добавляют ацетон (4 С) в количестве 380 мл (2 объема). Выпавший второй осадок, содержащий 5 -экзонуклеазу, собирают в вакуумах центрифугированием (3000 об/мин) и высушивают в 5 вакууме. Выход составляет 4 г и 47% по ферментативной активности.оТ неочищенного препарата. Фосфомоноэстеразная активность не обнаруживается при увеличении концентрации фермента в 10 раз и времени инкубации с субстратом в 4 раза. Из продуктов гидролиза РНК методом тонкослойной хроматографии обнаружены только нуклеотиды. 15 Таким образбм предлагаемый способ I очистки 5 -экзонуклеазы позволяет получать 5 -экзонуклеазу, синтезируемую Асс. сое11со1ог, не содержащую примесей фосфомоноэстеразы. 5 -экзо- 2О I нуклеаза может найти применение s пишевой промышленности и медицине для получения нуклеотидов из нуклеиновых кислот. В отличие от известного способа предлагаемый способ легко может бить реализован в условиях завода. ормула изобретения 30 1. Способ очистки 5 -экзонуклеазы Actinomyces сое11со1ог от фосфомоноэстеразы, включающий прогрев ферментного раствора в присутствии стабилизирующих добавок в течение 40-90мин и фракционирование, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества получаемого продукта, прогрев осуществляют при рН 4,7-5,0, при 45-50 С, в качестве стабилизирующих добавок используют сульфат аммония и рибонуклеиновую кислоту, а фракционирование осуществляют ацетоном в две стадии, соответственно 0,5 и 2,0 объемами по отношению к объему исходного раствора с отделением после первой стадии осадка фосфомоноэстеразы. 2. Способ go и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что нсгользуют 5 -экl зонуклеазу Actinomyces coelicolor шт. A-18. 3. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве исходного используют 4-6Ъ-ный раствор фермента в 0,005 М трио-НС1 буфере, содержащем 10 М МдСl, -2 4. Способ по и. 1, о т л и ч а ющ и и с.я тем, что сульфат аммония используют в количестве 8-11% от насыщения, а рибонуклеиновую кислоту в количестве 0,9-1,0Ъ. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Львова Т.Н., Артамонова О.И., Татарская P.È. Метод получения препарата экзонуклеазы A-5, свободного от примесей фосфомоноэстераз. Вып. 4. "Биохимия", 1975, т. 40, с. 703-710 (прототип) .
