Способ получения водонерастворимых биологически активных соединений

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТБОРИМЫХ БИОЛОгаЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ, включающий модификацию кремнеземной основы при 55-65°С действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-50 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35-40 мм Н, последующую , в случае необходимости, активацию модифицированного носителя и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений , отличающийся тем, что, с целью повышения стабильности целевых продуктов в водных средах, кремнеземную основу перед модификацией подвергают гидрофобизации путем обработки ее кремнеорганическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы, или действием ионизирукицего излучения с мощностью дозы 80-100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Hg- и температуре 50-60 0. 2.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что в качестве биологически активных соединений используют ферменты, нуклеотгады, кофакторы . 3.Способ по П.1, отличающийся тем, что активацию модифицированного носителя осуществляют (Л бифункциональными реагентами. 4.Способ по пп. 1 иЗ, отличающийся тем, что в качестве бифункциональных реагентов используют диамины, или диальдегиды, или ел дихлоран гидриды. 5.Способ по п. Г, отличаюо щийся тем, что в качестве крем00 неорганического соединения, содержащего триметилсилильные группы, исо пользуют гексаметилдисилазан, а об4i работку им кремнеземной основы осуществляют при кипении.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PECllVEi JIHH (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ll0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2561025/23-04 (22) 29. 12.77 (46) 23.12.85. Бюл. М- 47 (71) Ордена Ленина институт элементоорганических соединений АН СССР и Центральный научно-исследовательский институт хлопчатобумажной промьппленности (72) В.П.Варламов, A.B.Власов, Н.Н.Семенова, Б.Л.Цетлин и С.В.Рогожин (53) 577.15.07(088.8) (54)(5?) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОНЕРАСТВОРИМЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

СОЕДИНЕНИЙ, включающий модификацию кремнеземной основы при 55-65 С действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-50 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35-40 мм Н, последую- щую, в случае необходимости, активацию модифицированного носителя и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений, отличающийся тем, что, с целью повьппения стабильности целевых продуктов в водных средах, кремнеземную основу перед модификацией подвергают гидрофобизации путем обработки ее кремне. (51) 4 В 01 J 21/00, С 07 Н 19/00, С 07 К 17/14, С 12 N 11/14 органическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы, или действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 80-100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Н и температуре

50-60 С.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что в качестве биологически активных соединений используют ферменты, нуклеотиды, кофакторы.

3 ° Способ по п.1, (. т л и ч а ю— шийся тем, что активацию модифицированного носителя осуществляют бифункциональными реагентами.

Способ по пп, 1 и 3, о т л и— ч а ю шийся тем, что в качестве бифункциональных реагентов исполь- д зуют диамины, или диальдегиды, или дихлорангидриды. 3

5. Способ по п.1, о т л и ч а ю — (;Д шийся тем, что в качестве креинеорганического соединения, содер- (ф жащего триметилсилильные группы, используют гексаметилдисилазан, а об- р работку им кремнеземной основы осуществляют при кипении.

750804

Изобретение относится к способам получения водонерастворимых биологически активных соединений на кремнеземной основе.

В качестве биологически активных соединений используются ферменты, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, белки, липиды и т.д. Такие препараты могут быть использованы в пищевой, медицинской и других отраслях промы- 10 шленности, а также в научных исследо-. ваниях.

Известен способ получения ферментов иммобилизованных на кремнеземных носителях, предварительно покрытых органическими полимерами (нейлоном, полиакрилатом, поликарбами. дом}. Однако стабильность получаемых препаратов невысока, что, возможно, связано с удалением органического щ покрытия или с растворением самой кремнеземной основы.

Известен также способ получения водонерастворимых биологически активных соединений на кремнеэемной осно- 25 ве, включающий модификацию кремнеземной основы путем покрытия гидрофильными органическими полимерами, последующую, в случае необходимости, активацию модифицированного носителя и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений„ например ферментов, липидов, нуклеотидов. Модификация кремнеземной основы заключается в

35 том, что ее подвергают действию ионизирующего излучения с мощностью дозы 40-100 рад/с при 55-65 С в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35-400 мм Н . Активацию модифицированного носителя обычно осуществляют с помощью бифункциональных реагентов, например диаминов, диальдегидов, дихлорангидридов. Однако указанный способ имеет следующий недостаток. Полученные этим способом водонерастворимые препараты не обладают достаточной стабильностью в водных средах, Это объясняется тем, что кремнеземная основа при

50 рН 7 начинает растворяться и это особенно сказывается в длительных процессах. Гидрофильное органическое покрытие не защищает кремнеземную основу от растворения, что приводит к постепенному падению емкости

55 носителя и уменьшению активности полученных биологически активных препаратов.

Целью предлагаемого изобретения является повышение стабильности водонерастворимых биологически активных соединений в водных средах.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе перед модификацией кремнеземную основу предварительно гидрофобизуют обработкой ее кремнеорганическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы либо действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 80100 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Н и температуре 50-60 С.

Повышение стабильности связано с уменьшением растворения кремнеземной основы, экранированной гидрофобным покрытием. Для того, чтобы гидрофобное покрытие защищало кремнеземный каркас от растворения в водньгх средах, оно должно быть достаточно плотным, чтобы препятствовать диффузии молекул воды к каркасу, и должно быть связано с основой прочными ковалентными связями. Получение такого покрытия достигается обычно путем кипячения основы в растворе гексаметилдисилазана или прививкой к поверхности гидрофобного полимера— полистирола.

Согласно изобретению описывается способ получения водонерастворимых биологически активных соединений, включающий гидрофобизацию кремнеземной основы путем обработки ее кремнеорганическими соединениями, содержащими триметилсилильные группы, например гексаметилдисилазаном, либо действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 80-100 рад!с в присутствии паров стирола при давлении 35-40 мм Нg и температуре

50-60 С, модификацию гидрофобизованной основы действием ионизирующего излучения с мощностью дозы 4050 рад/с в присутствии паров виниловых мономеров при давлении 35400 мм Н и температуре 55-65 С, последующую в случае необходимости активацию модифицированного носителя (обычно с помощью бифункциональных реагентов, например диаминов или диальдегидов, или дихлорангидридов) и обработку полученного носителя растворами биологически активных соединений (ферментов, нуклеотидов, кофакторов).

750804

Обычно для гидрофобизации в качестве кремнеорганического соединения, содержащего триметилсилильные группы, используют гексаметилдисилазан, а обработку им кремнеэемной основы осуществляют при кипении.

Описываемый способ дает возможность получать стабильные водонерастворимые биологически активные соединения, так как кремнеземный 10 каркас получаемых соединений экранирован от воздействия воды гидрофобным покрытием, Водонерастворимые биологически активные соединения, полученные дан- 15 ным способом, не теряют своей актив— ности в результате выдерживания в о течение 100 ч при 37 С в буфере

0,1М трис-НС8 рН 8,0, в то время как активность соединений, получен- 20 ных без гидрофобного покрытия, снижается в тех же условиях на 20-50Х в результате растворения кремнеземной основы.

II р и м е р 1. Макропористый кремнезем (30 г) суспендируют в

100 мл абсолютного гексана, добавляют 40 мл гексаметилдисилазана и кипятят 2 ч. Носитель промывают на фильтре гексаном (500 мл) и высушивают в вакууме. Полученный гидрофобизированный носитель помещают в стеклянную ампулу и откачивают до остаточного давления 10 мм Напри многократном замораживании и размора-35 живании. Носитель в ампуле облучают -Со 0 в течение 2 ч при мощУ ности дозы 40-50 рад/с в присутствии паров акриловой кислоты. Процесс

D проводят при температуре 60-65 С 40 и давлении паров акриловой кислоты

35-40 мм Н . Полученный носитель отмывают кипящим метанолом до постоянного веса. Получают производное с содержанием углерода до 20Х и с 45 концентрацией карбоксильных групп до 3 ммоль на 1 r носителя. Носитель 1 (2 г) суспендируют в 5 мл воды, добавляют 200 мг 1-циклогексил3-(2- морфолиноэтилкарбодиимида м-р- 50 толуолсульфоната) (водорастворимого карбодиимида), поддерживают рН 4,56,0 и прибавляют 100 мг панкреатической рибонуклеазы. Реакционную смесь перемешивают на качалке при 55

0-5 С в течение 4 ч. Водонерастворимый продукт промывают на фильтре

1M NaCe и водой до отсутствия белка

4 в промывках. Водонерастворимый продукт содержит 40 мг белка на 1 r носителя, сохраняя до 80Х исходной активности. В течение 10 дней работы фермента в 0,1 M фосфатном буфере (рН 7,5) не наблюдается потерь активности, Пример 2. Производное 1 (4 г) (см.пример 1) суспендируют в

100 мл абсолютного метанола, насыщенного НО, и кипятят 2 ч. Промывают метанолом (500 мл), суспендируют в

100 мл абсолютного тетрагидрофурана. содержащего 1 r LiA(IIy и кипятят при перемешивании 8 ч. Полученный носитель промывают тетрагидрофураном (200 мл), эфиром (200 мл) и высуши,âàþò на фильтре ацетоном. Носитель (2 г) суспендируют в 100 мл воды при рН 5,5-6,0; добавляют 800 мг водорастворимого карбодиимида и

200 мг уридин-5 -монофосфата. Перемешивают 4 ч и отмывают на фильтре

1M NACf и водой до отсутствия поглощения при 3 =260 нм, Водонерастворимый m одукт содержит до

50 мг нуклеотида на грамм носителя и стабилен в водных растворах при рН 2-8.

Пример 3. Макропористый кремнезем (30 г) помещают в стеклянную ампулу и откачивают до остаточного давления 10 мм Напри многократном замораживании и размораживании.

Носитель в ампуле облучают рентгеновскими лучами на установке ТРЦ-ЗА в течение 3 5 ч при мощности дозы

80-!00 рад/с в присутствии паров стирола при давлении 35 — 40 мм Н и о температуре 50-60 С. Полученнык носитель отмывают толуолом до постоянного веса и высушивают.

1идрофобиэированный носитель вновь подвергают облучению и проводят прививочную полимеризацию акриловой кислоты (см.пример 1). Получают носитель 2 с содержанием углерода до

20Х и с концентрацией карбоксильных групп до 2 ммоль на 1 r носителя. Носитель 2 суспендируют в 250 мл метанола, насыщенного хлористым водородом, и кипятят 2 ч при перемешивании. Носитель промывают водой, суспендируют в 200 мл воды и добавляют 30 мл гидразингидрата. Реакционную массу кипятят 3 ч, промывают водой до оТрицательной реакции на салициловый альдегид в промывках. ПолуР дактоР П.ГоРькова ТехРед А.Бой о

КорректоР О.Луговая

Заказ 8133/3 Тираж 540 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

5 ченное производное суспендируют в

10 мп 0,1 М ацетатного буфера (рН 5,0), содержащего 200 мг окисленного периодатом НАДФ. Перемешивают 2 ч, промывают на фильтре 1 М

750804 4

NaCf и водой до отсутствия поглощения при Л =260 нм в промывках. Иммобилизованный препарат содержит до

50 мг НАДФ на 1 г носителя и стабилен в водных средах при рН 5-8.