Способ определения степени очистки биологических жидкостей сорбентами при экстракорпоральной детоксикации

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (1)934376

Союз Советсиик

Соцмалистимесиик республик (61 j Дополнительное к авт. свнд-ву(22) 3à e e o 21. 05. 80 (21) 29S26S3y28-13 с присоединением заявки М— (23) П риоритет—

Опубликовано 07. 06. 82. Бктллетень М 21

В

Дата опубликования описания 07. 06. 82 (51)М. Кл.

С 01 N 33/48

Ркударстаеиивй комитет

CCCP оо делам иаабретеиий и открытий (53)УДК 612 11 (088. 8) В.Д. Горчаков, Ю.A.Ëåéêèí, 8.И.Сергиенко, Д.Д. Петрунин, Т.А.Мрачковская и Н.Г.Евсеев (72) Авторы изобретения

2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н.И.Пирогова (7I) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ

ЖИДКОСТЕЙ СОРБЕНТАМИ ПРИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОЙ

ДЕТОКСИКАЦИИ

Изобретение относится к медици не, а именно к процессам экстракорпоральной детоксикации биологических жидкостей.

Известен способ определения степени очистки биологических жидкосS тей сорбентами при экстракорпоральной детоксикации путем проведения в ходе детоксикации серии биохимических анализов крови или биологичесто ких жидкостей с последующим расчетом количества извлеченного токсическоro агента или определения показателя элиминации или клиренса(1 1.

Недостатком известного способа является невысокая точность, так как в ходе сорбции целевых токсических агентов их концентрация в крови или биологической жидкости начинает падать, что в свою очередь приводит к выходу депонированных в тканях количеств токсических агентов, а следовательно, к увеличению их концентрации в крови или биологической жидкости. Указанное явление не позволя ет также провести корректорный анализ связи степени детоксикации и клинического эффекта операции экстракорпоральной детоксикации. Кроме того, при сорбции некоторых компонентов биологических сред, концентрация которых крайне мала, определение сорбированных на колонке количеств по данным анализа биологических жидкостей приводит к значительным ошибкам.

Существенным недостатком способа является также необходимость отбора значительного количества проб крови или биологических жидкостей, что нередко требует их компенсации, а также необходимость проведения большого числа трудоемких биохимических анализов. Причем в ряде случаев (экстракорпоральная детоксикация у детей и др.), когда общий забор проб крови или биологических жидкостей резко ограничен, применение из76 4

3 9343 вестного способа приводит к значительным ошибкам. Кроме того, в случае гемосорбции, во всех пробах крови необходимо определять показатель гематокрита, так как его величина в ходе перфузии варьирует в интервале до 304, а концентрация практически всех токсических агентов определяется в плазме.

В случае извлечения из крови или 1а биологических жидкостей малосорбируемых компонентов, или при относительно высокой скорости гемоперфузии известный способ практически не применим, так как разность концентраций 15 извлекаемых компонентов на входе и выхрде из колонки находится в пределах ошибки анализа.

Цель изобретения - повышение точности и чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что при осуществлении способа определения степени очистки биологических жидкостей сорбентами при экстракорпоральной детоксикации путем исследования содержания токсических веществ сорбент после проведения сорбции отделяют от биологической жидкости, выделяют сорбированные им вещества, проводят из идентификацию и по их количеству определяют степень очистки биологических жидкостей.

Способ осуществляется следующим образом.

После проведения экстракорпоральной детоксикации, сорбент промывают физиологическим раствором или центрифугируют, после чего сорбированные компоненты вытесняют подходящими элюентами и их концентрация в раст4а воре определяется стандартными, затем производят перерасчет на все количество сорбента. При необходимос. ти для упрощения анализа и повышения его точности анализируемые компонен45 ты концентрируют, отгоняя растворитель.

Способ позволяет также проводить идентификацию неизвестных токсических агентов белковой природы, сконцентрированных на сорбенте. С этой целью проводят фракционирование сорбированных белков и их комплексов с токсическими веществами с последующим определением белковых фракций иммунохимическими и биохимическим методами, а также оценкой их токсичности биологическими тестами.

При определении количества сорбированных соединений белковой природы, удерживаемых на сорбенте очень прочными связями, в том числе полиэлектролитными взаимодействиями, предлагается проводить их частичный или полный гидролиз с последующими определением в гидролизате полипептидов или аминокислот и пересчетом на исходное количество белка.

При анализе неорганических соединений (ионы тяжелых металлов, неорганический фосфор и т.д.) сорбент подвергают полной деструкции путем

"мокрого сожжения" в смеси серной кислоты и окислителя, например азотной или хлорной кислоты, с последующим анализом полученного раствора.

Пример 1. Гемосорбент МХТИ-2А, полученный на базе сильноосновного анионита, после проведения гемосорб ции у больного с печеночной недостаточностью и гипербилирубинемией про" мывают в колонке 50-ю объемами физиологического раствора, отбирают 10 мп .влажного гемосорбента и центрифугируют при 2000 с в течение 45 мин, затем высушивают в вакууме над Р О до постоянного веса. Навеску сухого гемосорбента (около 3 r) экстрагируют в аппарате Сокслета 50-ю мл хлороформа в течение 6 ч, затем в экстракте определяют концентрацию билирубина по методу Индрашека. Сорбция билирубина, определенная по описанному методу, составляет 1,2 мг/г сорбента, по данным расчета из выходных кривых сорбции - 1,0 мг билирубина на 1 r сорбента.

Пример 2. Гемосорбент на базе модифицированного алюмосиликата после проведения гемосорбции у кролика с моделью гиперхолестеринемии промывают в колонке 50-ю объемами физиологического раствора, центрифугируют при 10000 ф в течение

60 мин, затем высушива :;т в вакууме над Р О до постоянного веса. Навеску сухого сорбента (около 2 г экстрагируют в аппарате Сокслета 50 мл смеси хлороформ : метанол в соотно шении 2:1 в течение 6 ч. Затем экстракт концентрируют, удаляя растворитель на роторном испарителе и определяют концентрацию холестерина.

Емкость алюмосиликата по холестерину составляет 2,7 мг/г.

Пример 3. Гемосорбент ИХТИ-2К, полученный на базе макропористого суль5 934 фока тионита после проведения гемосорбции у больного с гиперкалиемией, промывают в колонке 50-ю объемами физраствора. 5 мл влажного гемосорбента центрифугируют при 2000 в s течение 45 мин, затем переносят в колбу, заливают 50 мл водного О, 5 М раствора соляной кислоты и выдерживают при перемешивании в течение 10 ч.

Затем сорбент отделяют, промывают водой до нейтральной реакции и сушат в вакууме над KGH до постоянного веса. Соляную кислоту после элюирования нейтрализуют водным раствором аммиака и определяют в растворе содержание ионов калия. Емкость гемосорбента МХТИ-2К, определенная по описанному способу, составляет

0,41 мэкв ионов калия на 1 г, расчет по выходным кривым сорбции дает 20 величину 0,38 мэкв/г.

Пример 4. Гемосорбент на базе активного угля СКТ-ба после проведения гемосорбции у больного с 25 отравлением люминалом промывают в колонке 50-ю объемами физраствора, отбирают 10 мл влажного сорбента, центрифугируют при 5000 ф в течение 30 мин, затем высушивают в вакууме з0 над Р О до постоянного веса. НаЬеску сухого сорбента (около 3 r) экстрагируют в аппарате Сокслета 50 мл этанола в течение 8 ч и затем опре- деляют в экстракте концентрацию люминала по общепринятой методике.

Сорбция люминала, определенная по описанному способу, составила 3,6 мг/г рассчитанная из данных, анализа крови до и после колонки 4,1 мг/г.

Пример 5. Гранулированный активный уголь марки "ИГИ", полученный на основе каменноугольного сырья, после проведения гемосорбции у

45 больного псориазом, промывают 50-ю объемами физраствора. 5 мл влажного угля центрифугируют при 2000 с1, в течение 20 мин, заливают 5 мл 0,5 M водного раствора Na выдерживают при 35 С и перемешивании в течение

60 мин. Элюат отделяют центрифугированием при 3000 ф в течение 15 мин, затем подвергают иммунодиффузионному анализу с использованием стандартных тест-систем к индивидуальным сывороточным антигенам,a также про" водят диск-электрофорез и определяют общий белок.

376 6

В элюате определены и пересчитаны на 1 г сухого угля: 0,008 мг/г альбумина, 0,04 мг/г дд 6, 0,01 мг/г

ilgA, 0,004 мг/г Gc -глобулина.

Пример 6. Гемосорбент на базе силикагеля марки KCK промывают в колонке 50-ю объемами физраствора, затем центрифугируют при 2000, в течение 60 мин. 3 г силикагеля (в пересчете на сухой вес ) инкубируют с 5 мл сыворотки донора в течео ние 1 ч при 35 С и перемешивании, после чего сорбент отделяют от сыворотки центрифугированием при 5000 ф в течение 45 мин, промывают 150 мл физраствора, отделяют от физиологического раствора и обрабатывают 5:мл

0,2 М раствора Иэ НРО в течение

45 мин при 35 С и перемешивании. о

Элюат отделяют центрифугированием при 3000 Ч. в течение 15 мин, затем подвергают иммунодиффузионному анализу использованием стандартных тестсистем к индивидуальным сывороточантигенам, а также проводят диск-электрофорез и определяют общий белок.

Данные анализа: силигатель сорбировал 0,25 мг/г альбумина, 0,07 мг/г трансферрина 0,007 мг/г j G

Пример 7. Гемосорбент на базе активного угля AP-3 после проведения гемосорбции у больного с печеночной недостаточностью промывают 50-ю объемами дистиллированной воды и

30-ю объемами физраствора. 10 мл влажного гемосорбента центрифугируют при 2009 ф в течение 15 мин, затем заливают 150 мл 20 -ного водного раствора соляной кислоты и выдерживают при 80 С и перемешивании в течение о

5 ч. Затем сорбент отделяют, промывают водой до нейтральной реакции и высушивают в вакууме до постоянного веса. Раствор кислоты после гидролиза белка на сорбенте нейтрализуют 353-ным водным раствором NaOH и определяют в нем концентрацию белка биуретовой реакцией с калибровкой по гидролизованному в аналогичных условиях альбумину;

Количество белка, сорбированное из крови углем АР-3, составляет

6, 1 мг/г.

Пример 8. Гемосорбент на ба- зе тиофосфонового макропористого катионита после проведения гемосорбции у собаки, затравленной сулемой, промывают в колонке 50-ю объемами физраствора, отбирают 10 мл влажно-, 934376

Анализируемый компонент

Количество сорбированных компонентов, определенное по

Гемосорбент выходным кривым предлагаемому способу

1,00 + 0,21

1,20 + 0,05

2.7 4 0,3

Билирубин, мг/г

Холестерин, мг/г

МХТИ-2А

Не может быть проведен

Алюмосиликат

0,38 + 0,04

0 41 + 0 02

0,30 + 0,04

3,6 + 0,5

Калий, мзкв/г

Ртуть, мг/г

Люминал, мг/г

МХТИ-2К

0,33 + 0,16

СТф

4,1+ 1,6

СКТ-6А

Общий белок, мг/г

5,8+ 1,2

6,1+0,4

АР 3

Не может быть 0,04 проведена 0,01 Д, мг/г

JgP, мг/г

ИГИ

С с-глобулин, мг/г

0,004

О, 008

Альбумин, мг/г

Трансферин, мг/г

0,07

Не может быть проведена

0,007

0,25 д G, мг/г

Альбумин, мг/г

Силикагель

КСК

ro сорбента и высушивают в вакууме над Р<0<до постоянного веса. Навеску сухого гемосорбента (около 1 г) помещают в колбу Кьельдаля, заливают 20 мл концентрированной серной кислоты, нагревают до обугливания и кипятят около 15 мин. Затем к кипящей смеси добавляют по каплям 10 мл концентрированной азотной кислоты и кипятят до обесцвечивания раствора.

Смесь охлаждают, нейтрализуют и определяют содержание ртути по реакции с дитизоном.

Сорбция ионов ртути из крови, определенная описанным методом, составляет О, 30 мг/г, расчет из выходТаким образом, применение предлагаемого способа позволяет значительно повысить точность определения коных кривых сорбции дает величину

0,33 мгlг.

Предлагаемый способ по сравнению с известным, заключающимся в расчете из выходных кривых, характеризуется более высокой точностью, а также более широкими возможностями в плане анализа количества компонентов, сорбирующихся в небольших количеств вах.

В таблице приведены статистически обработанные данные серий гемосорбций на животных и данных стендовых испытаний ряда гемосорбентов.

Величина доверительного интервала рассчитана для вероятности P i 0,95. личества сорбированных компонентов s случае, когда сорбция может быть рассчитана по известному способу

Составитель Л.Соловьев

Техред.А. Ач Корректор 0 Билак

Редактор В. Пилипенко

Тираж 887- Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 3-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 3927/40

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 9 934376 10 обработки выходных кривых. Кроме Toro» ческих веществ, о т л и ч а ю щ и йспособ по сравнению с известным имеет с я тем,что, с целью повышения точзначительно более высокую чувствитель ности и чувствительности способа, ность, позволяя определить микроколи сорбент после проведения сорбции чества сорбированных компонентов (на- g отделяют от биологической жидкости, пример, иммуноглобулинов). выделяют сорбированные им вещества, проводят их идентификацию, и по их количеству определяют степень очистФормула изобретения ки биологических жидкостей. о

Источники информации, Способ определения степени очистпринятые во внимание при экспертизе ки биологических жидкостей сорбентами при экстракорпоральной детоксикации 1. Лопухин 10.È., Молоденков М.Н. путем исследования содержания токси- Гемосорбция. М., "Медицина", 1978.