Способ индикации микроколичеств липидов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик!

>991304 (б1) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 160781 (21) 3316579/28-13 с присоединением заявки Йо (23) Приоритет

Р М g+ з

G 01 N 33/52

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 230133, Бюллетень Но3

)$3) УДК 616.07 (088. 8) Дата опубликования описания 239133

/, : 7

С.Г. Благородов и H.A. Дмитриева /

I ."1... ..: (/

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский . / институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены (72) Авторы изобретения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИНДИКАЦИИ МИКРОКОЛИЧЕСТВ ЛИПИДОВ

30

Изобретение относится к биохимии,, а именно к способам индикации микроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля.

Известен способ индикации микроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля, включающий обработку хроматограмм в камере с парами иода до проявления окрашенных пятен липидов. Время анализа составляет 40-50 мин,чувствительность способа — до 1 мкг ненасыщенных липидов (1 ).

Однако этот способ является дли-. тельным и позволяет определять липиды только с ненасыщенными связями.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ индикации микроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля, представляющий обработку хроматограмм раствором флуорохрома с последующим обнаружением на них пятен липидов в ультрафиолетовом свете.

Готовые хроматограммы обрабатывают раствором родамина В . Способ позво- . ляет обнаруживать фосфолипиды и воска (2).

Однако известный способ не позволяет обнаруживать все классы липидов (триглицериды, эфиры жирных кислот) одновременнс, а также достаточно длителен (40-50 минут) и обладает низкой чувствительностью (5-10 мкг).

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу индикации микроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля путем обработки хроматограмм раствором флуорохрома с последующим обнаружением на них пятен липидов в ультрафиолетовом свете, в качестве флуорохрома используют раствор 2,7,10-производных ксантена — пиронина G или родамина С или родамина 6Х в количес20 тве 0,005-0,025Ъ, а перед облучением ультрафиолетовым светом хроматограммы обрабатывают парами иода в течение 3-5 мин.

До нанесения на пластины силикагель суспендируют в 0,005-0,025%-ном (вес) водном растворе 2,7,10-производных ксантена общей формулы

991304 где Н1-N(CHq), - NHC>H, R - м(сн,),, - NHc,н, СООН СООС И

Таблица 1

Пиронин G Родамин С Родамин 6Ж

10 5 10 6 10 10 10 10 6 10 10 е 10 10 10 1 10

Класс липидов

Обычное

I I

10 10 10

Фосфолипиды (кефалин) +

Холестерин свободный +

+ +

+ +

Свобод ные жир-у ные кислоты (пальмитиновая кислота) + при условии: а) R1 -N(CH3)2 к2 и(снз)2 к -и пйронин 6 б) Rp -N(CH3)g

N(CНэ4

;Q

СООТГ родамин С

a) Rq-NHC Н к -ынс н, я,-о

ЛООС И,, родамин 6Ж

При облучении ультрафиолетовым светом липиды обнаруживают н виде темных пятен на общем светящемся фоне. Эффект имеет место за счет липотропности иода и его способности в ионной форме гасить флуоресценцию.

Пример 1. Готовят суспензию 2,5 г силикагеля в 6 мл 0,005%ного (вес) водного раствора пиродина G и наносят ее на пластину 9х12см

После высушивания пластины активируют при 115 С 30 мин. На стартовую линию наносят исследуемый раствор— экстракт по Фолчу из биопрепарата .

"Протеин" - н количестве 0,001 мл с содержанием липидон в пробе

50 мкг. В качестве контроля берут экстракт по Фолчу из сыворотки крови, распределение липидов которого в данной системе растворителей известно и проверено по стандартным растворам кефалина, холестерина, 5 пальмитиновой кислоты, триолеина и эстерифицированного холестерина.

Липиды фолчевских экстрактов поднергали хроматографии в системе петролейный эфир:диэтиловый эфир:ледяная

16 уксусная кислота (90!10:1). После разделения липидов пластины помещают на 3-5 мин в камеру с парами иода и затем обнаруживают пятна липидов при облучении ультрафиолетовым снетом (А = 180-320 нм).

Пример 2. Аналогично примеру 1 готовят пластины для хроматографии, на стартовую линию наносят в виде точечных пятен по 1 мкл хлороформного раствора липида (кефалин, свободный холестерин, пальмитиноная кислота, триолеин, эстерифицированный холестерин). На одну пластину наносят один класс липидов и виде растворов с заданным содержанием вещества в 1 мкл, для этого готовят серий разведений — 10, 10 6, 10 l, 10 э г/мкл. После проведения хроматографии и проявления пятен в парах иода, как описано в примере 1, пятна липидон обнаруживают в ультрафиолетовом свете.

Аналогично готовят взвесь силикагеля в 0,005%-ном (вес) растворе (водном) родамина С или родамина 6Ж и наносят ее на пластины для хроматографии, После приготовления пластин проводят хроматографию и проявление липидон.

Чувствительность предлагаемого спо40 соба к различным классам липидов в сравнении с известным определением в парах иода представлена н табл. 1.

991304 ° продолжение табл. 1

1! I

Пиронин G !

Обычное (1

Родамин С

Класс ,липидов

М

Т

10 10." 10- 10-8

10 10 10

10 10 6 10 " 10 8

10 10 1 11

ТрнглицеДИДЫ (триолеин) + + + - + + + + + + + +

Холесте, рин эстеркфицированный + + +

+ + .+ " "+ + + - +

П р и м е ч а н и е. Здесь и далее в таблицах в каждом определении не менее

4 опытов.

Как видно иэ табл. 1, чувствительность предлагаемого способа на порядок выше по отношению ко всем классам липидов, т.е. составляет

10 " вместо 10-ь r для всех классов, кроме пальмитиновой кислоты, для которой чувствительность составляет

10"6 вместо 10 0 г.

Пример 3. Готовят суспенэию 2,5 г силикагеля в 6 мл водного раствора пиронина G, родамина С и родамина 6Ж различных концентраций и проводят обработку пластин, хрома20 тографию и проявление липидов по примеру 1. Липиды на пластины наносят в соответствии с определяеьым минимумом 10 r для всех классов липидов, кроме свободных жирных кислот, для которых определяемый минимум 10 r.

Результаты определения установления оптимальной концентрации и ее пределов для водных растворов флуоЗО рохромов при определении липидов предлагаемым способом приведены в табл. 2..7

1 „» ! ! о

I

<ч

1 (б

1 х. !!

I

Ц

О!

+1

1 х

Э х х

Э а -!

1

1

1

+I с

Э х о э о

Э

8 о

lA

Ю о с о

Ю т-1 о!»л с

1 !

О!

Ul

ГЯ с"» Г с 1 о т"» о

u) о

+! Л 1 о

Ю ln с о

+! о

Э

2 х о х и о

l ф

4» Х 441, И 4: O цэ и

Э 4» Ф

0 Х

4» 4Ц М! I х э о

4» ЯФ иихф

e r. х ц э охо м х а О

3mo

ЛО4:

4 Х И

4Хйм с"»

I !

I с ф

1 а! о

1 х

1 4» и

1 Э

I 0

1 Х

I 1 (б

1 0

l 4» х

I Э

1:5! х! о

I Х

1

1 л 1 о о ич -! ю l

< > I 1

K с-! I 3

iО Ю i A

1 C(lo 1

О с I

I Ai ю 1 — Ф вЂ” Ф

1

I

LA

ГЧ (с» т-» 1 с-» 1

o I т-» ю с.» I о с о!

I

1 Ф 1

1! I o 1

1! ч1

ra I ь сО

I I=I (1 О lo

О

1 I — + — 1

Х1о14 1

I I х о

o — + — ч

I 0ю1

1 Х W I

4 I o с

1 — —

tA 1

<ч I с-! (с4 с

+1 +

991304

1 +

1 +

+ +

I о е g,õ

I 1 .Э! 1х ! Иg tll

o >em э хо

4: х0,а о хэх

Z 0,i х .х

«Г

3 и

Э а о е х х х

Э Э х х д

Ц

Е

g u

g а х

Ц и о х

l A

Ц

+ Э

+ 4ч

991304

Кефалин

Холестерин свободный

Пальмитиновая кислота

Триолеин

+ + + - + + + + + + + + Эстерифинированный холестерин

Формула изобретения

ВНИИПИ Заказ 122/61 :Тираж 871 Подписное

Филиал ППП "Патент", r.Ужгород, ул.Проектная,4

Как видно иэ табл. 2, оптимальная концентрация флуорохромов для определения всех классов липидов 0,005%.

Снижение концентрации до 0,001% не дает четкой картины при определении всех классов липидов, увеличение свыше 0,025% не влияет на результат определения, но сильное свечение фона приводит к быстрому утомлению зрения. Поэтому рабочие концентрации растворов лежат в пределах 0.0250,005%. Оптимальная концентрация в этих пределах практически не выявляется.

Пример 4. Определение оптимального времени проявления пятен

Как видно из табл. 3, оптимальное время проявления пятен липидов составляет 3-5,мин. Сокращение этого времени не дает описанного эффекта, а.увеличение его приводит к гашению флуоресценции не только в местах локализации липидов, но и по всей пластине.

Предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет сократить время анализа до 20-25 мин, повысить чувствительность определения на

1-2 порядка, а также определять широкий круг липидов независимо от их класса и иредельности.

Способ индикации микроколичеств липидов на хроматограммах в тонком слое силикагеля путем обработки липидов на хроматограммах, флуорохромированных 0,005%-ным водным раствором пиронина G.

Аналогично примеру 1 готовят 5 пластин, флуорохромированных 0,005%ным водным раствором пиронина С, родамина С или родамина 6Ж. На стартовую линию всех пластин наносят в виде точечных пятен хлороформные растворы липидов в концентрации

10 г/мкл в количестве 1 мкл. Хроматографию всех пластин проводят обычным способом, а затем помещают их в камеру с парами иода. Время проявления пятен липидов для каждой пластины указано в табл. 3.

Таблица 3 хроматограмм раствором флуорохрома с последующим обнаружением на них пятен липидов в ультрафиолетовом све45те,отличающийся тем, .ч-.;о, с целью повышения чувствительности и ускорения способа, в качестве флуорохрома используют раствор

2,7,10-производных ксантена — пиро50 нина G . или родами íà С, или родами на

6Ж в количестве О, 005-5, 025%, à перед облучением ультрафиолетовым светом хроматограммы обрабатывают парами иода в течение 3-5 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Roch L. А.,Grossberg $. Е.

"AnaI..Biochem.", 1971, 41, р. 105.

2.Алимова Е.К., Аставацатурян А.Т., 60

Исследование жирных кислот и липи0 дов методом хроматографии. м., "иедицина", 1967, с. 41.