Способ получения комплекса еас 1,4,2 для количественного определения функциональной активности с 3 фракции комплемента

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

ЮЛЮ

РЕСПУБЛИК эЮ А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3311474/28-13 (22) 02.07.81 (46) 15.06.84. Бюл. Р 22 (72) А.С.Шаронов и В.H.Ïîòàïaâ (71) Владивостокский государственный медицинский институт (53) 615.375(088.8) (56) 1. Е.Кэбот, М.Мейер, Экспериментальная иммунохимия. М., "Медицина", 1968, с. 205.

2. Там же.,SU.„1097277 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА

ЕАС 1,4,2 ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ С 3

ФРАКЦИИ КОМПЛЕМЕНТА, включающий последовательное присоединение к ЕА комплексу очищенных фракций комплемента С 1, С 4 и С 2, о т.л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности и стабильности целевого продукта и упрощения способа, присоединение С 2 фракции комплемента осуществляют с помощью третьего реагента R>, окисленного йодом.

Окисление К производят смешиванием с равным объемом оптимально .разве- 45 денного стандартного раствора йода (предварительно испытывают разведение раствора иода 1/5, 1/7, 1/10

1/12 в 0,09 M растворе фосфатного буфера, рН 6,0) в течение 5 мин 50 при комнатной температуре. К обрао ботанный иодом, диализуют при 4 С в течение ночи против 10 л вероналового буфера с рН 7,2-7,4. Диализат—

oxyR>.

SS

Пример 2. К 5 мл охлажденной гемосистемы (EA) добавляют 0,25 мл цельного oxyR> и выдерживают 15 мин

1 10972

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии.

Известен способ получения комплекса ЕАС 1,4,2 при помощи обработки неразведенной сывороткой морской 5 свинки сенсибилизированных эритроцитов барана в специально подобранных условиях температурного режима11 3.

Однако известный способ недоста l точно чувствителен к С 3. 10

Известен также способ получения комплекса, включающий последовательное присоединение к ЕА очищенных фракций комплемента С 1, С 4 и С 2, t причем присоединение С 2 осуществляют в буфере, содержащем

0,00015MCa++ и 0,0005И М Лри специально подобраных условиях температурного режима (2 j.

Однако известный способ трудоемок, а полученный комплекс недос= таточно стабилен и чувствителен к С 3.

Целью изобретения является упрощение способа и повышение стабильности и чувствительности комплекса 25

ЕАС 1,4,2.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу, включающему последовательное присоединение к ЕА комплексу очищенных фракций 30 комлемента С 1, С 4 и С 2, присоединение С 2 фракции комплемента осуществляют с помощью третьего реагента R3, окисленного йодом, Пример 1. Приготовление R3 и его окисление в oxyR :10 мл сме3 шанной сыворотки (от 15 -20 человек) ресуспензируют осадок зимозана, полученный из 5 мл исходной взвеси. Полученную смесь помещают в водяную баню при 37 С на 1 ч с помешиванием через

10 мин. После прогревания смесь центрифугируют. Центрифугат R3, 77. при 4 С, после чего комплекс

EAC 1,4,2оху образован и может быть применен в микро- или макроварианте способа определения С 3.

Постановка макрометода определеt ния С 3 †фракц.

Обычным методом готовится 17-ая гемосистема (ЕА), к которой добавляется oxyR> в количестве 5 мл реаген-. та на 100 мл гемосистемы. Полученную смесь вццерживают 15 мин при 4 С, в результате чего образовывался комплекс ЕАС 1,4,2

Испытуемую сыворотку прогревают при 52 С в течение 30 мин.

Основной опыт ставят по схеме приведенной в табл.1.

Пробирки выдерживаются в термостате при 37 С 1 ч, после чего производится определение активности С 3 по

100Х-ному гемолизу в соответствии со второй схемой приведенной в табл,2.

Постановка микрометодом. К 5 мл охлажденной 27-ной гемосистемы (ЕА) добавляют 0,25 мл цельного окисленного иодом реагента (oxyR ), выдерживают 15 мин при 4ОС для образования комплекса ЕАС 1,4,2, после чего смесь подогревается до +45 С и смешивается с равным объемом охлажденной до 45 С 2Х-ной агарозы.

Полученную смесь тщательно перемешивают и заливают в камеру, приготовленную из двух фотопластин с IT-образной прокладкой между ними толщиной

О, 1 см, зафиксированной прищепками.

После застывания геля верхняя пластина и прокладка снимается и в геле пробойником делают микролунки диаметром 0,2 см на расстоянии 1 см.

В ряд лунок вносят гретую сыворотку в различных разведениях: цельная

1 20, 1 30, 1 40, 1 50, 1 60, 1 70, 1:80, 1:90, 1: 100. В остальные лунки вносят опытные пробы гретой неразведенной сыворотки, Пластинку с 1робами ставят во влажную камеру при 37 С на 3 ч.

По истечении времени определяют титр контрольной сыворотки (проба, где еще наблюдается заметный гемолиз) и измеряют диаметры опытных проб.

Гемолитическая активность контрольной сыворотки равна обратной величине титра в .гемолитических единицах на миллиметр (гем.ед.мл).

1097277 4 тивность СЗ, способная гемолизировать весь введенный комплекс) и смесь инкубируют при 37 С в течение 1 ч.

Полученные результаты показывают следующее: комплекс ЕАС 1,4,2 при его хранении при О С уже через 2 ч начинает распадаться, о чем свидетельствует неполное его разрушение в реакции с добавлением CÇ (на дне после

10 центрифугирования. реакционной смеси после инкубации остается небольшой осадок неразрушенных эритроцитов).

Активность опытной пробы определяется по формуле д х „ о- * к где С вЂ” активность C 3 в опытной о пробе, I I

С вЂ” активнбсть С 3 в контроK ле;

Д вЂ” диаметр кольца лизиса в о опыте, Д вЂ” диаметр кольца лизиса в

K контроле.

Введение в способ определения С 3 ( фракции комплемента оксиленного тре- l5 тьего реагента 0XY R и обработки исследуемого материала при 52 С в тео чение 30 мин позволяет значительно улучшить метод определения С 3-фракции комплемента. Это выражается уве- 20 личением чувствительности (в 2030 раз), его специфичности, в его техническом упрощении. В результате возможна постановка высокочувствительного метода определения важного. 25 лабораторного показателя (С З).

Для доказательства повышения стаI бильности и чувствительности к С 3 комплекса ЕАС 1,4,2 OXY по сравнению с комплексом ЕАС 1,4,2 прототипа 30 проводят следующие эксперименты.

Прогретую исследуемую сыворотку разводят 1:20, 1:30, 1:40, 1:80, 1:90, 1:100, 1: 110. К разведениям исследуемой сыворотки добавляют соответственно комплекс EAC 1,4,2 и полученный данным способом

EAC 1,4,2 в рабочей дозе (1X взвести. комплекса в объеме 1 мл к

0,5 мл разведенной сыворотки). Через 4р

1 ч инкубации при 37 С производят учет результата по 1007.-ному гемолизу. Титр исследуемой сыворотки при работе с комплексом ЕАС 1,4,2

1:30, предлагаемый - 1: 100. Это сви- 45 детельствует о большей чувствительности предлагаемого комплекса

EAC 1,4,2 присоединять находящийox> ся в исследуемой сыворотке С 3. Это соответственно повышает в конечном итоге разрешающую способность метода определения СЗ, Пригото:.генные комплексы ЕАС I 4 2

° CX

Э Э и ЕАС 1,4,2 выдерживают при ОоС о, о

Э

37 С, 40 С 15 мин, 30 мин 1 ч, 2,5,10ч, Затем комплексы вносят по 1 мл в пробирки с прогретой исследуемой сывороткой, взятой в рабочей дозе (акПри хранении данного комплекса при

37 С его заметное разрушение начинао ется через 60 мин, при 40 С вЂ” через 15 мин. В то же время комплека

ЕАС 1,4,2 " хорошо сохраняется при

oху ь

0 С и после 10 ч инкубации выявляется незначительная потеря его активности.

Признаки снижения активности комплекса ЕАС 1,4,2 1" при хранении при о

37 С появляются только через 5 ч, при 40 С вЂ” через 2 ч. Таким обра0 зом комплекс ЕАС 1,4,2 более стабиОХ лен по сравнению с ЕАС 1,4,2 проI тотипа.

Данный способ получения комплекса

ЕАС 1,4,2 при помощи (К. ) имеет преимущества перед известными, так как получение ЕАС 1,4,2 первыми двумя известными способами при помощи неразведенной сыворотки (имеются все компоненты, в т.ч. и С 3) требуют соблюдения строгих режимных условий блокировки присоединения С 3 к ЕАС 1,4,2 температурой или формальдегидом, что усложняет выполнение метода. Для последующей работы с комплексом необходима дополнительная стадия отмывки полученного комплекса от С 3, 1 что требует дополнительной затраты времени и не безразлично для сохранения функционально активного FAC 1,4,2 принимая во внимание его лабильность.

Эти недостатки нивелируются при применении третьего реагента, который получается несложным способом и длительно может сохраняться. Получение комплекса ЕАС 1,4,2 становится упрощенным и представляет собой простое смешивание оптимальных количеств гемосистемы (EA) и R> за 15 мин до опыта.

Использование R. для получения комз плекса ЕАС 1,4,2 значительно упрощает способ. Окисление иодом С 2 и введе,!

1097277 ние- С 2 У в- состав комплекса позволяет более стабильный и более чувствительный к СЗ (в 20-30 раз) комплекс

ЕАС 1, 4 2 Ох У

Ряд пробирок

1) 111 1

Контроль

Ингредиенты

4 5 6 7

1 2 3

Гретая сыворотка иепытуемая 1:40 0,1

015 02 025 03 035 04

Вероналовый буфер Пиллимера

0 5

04 035 03 025 02 015 01

1Х-ная взвесь комплеие а охи

1,0

10 t0, 10 10 10 10 1,0

Таблйца

Разведение исследуемой сыворотки по пробиркам

Активность

С 3

i 57

1:80

1:66

1:200 1:133

1: 100

1:50 в гемолизе, ед/мл

133

100

П р и м е ч а н и е.: (+) — есть гемолиз, (-) — нет гемолиза

Составитель Г.Крюкова

Редактор М.Товтин Техред М,Кузьма

Корректор А. Тяско.Заказ 4086/4 Тираж 688

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 +»

Подписное филиал ННН "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Исследуемая проба, Ф

Способ может быть использован иммунологами, патфизиологами, аллергологами, онкологами при определении функциональной активности СЗ.

Таблица