Рекомбинантная плазмидная днк pifn- @ тrр, кодирующая синтез человеческого иммунного интерферона
Изобретение относится к генетической инженерии и бнотехнологии, конкретно к способам получения практически важных белков методом микро-; биологического синтеза. Целью изобретения является увеличение выхода иммунного интерферона. Увеличение выхода интерферона обеспечивается наличием в плазмиде синтетического участка связывания рибосом и последовательности , расположенной между ним и индуцирующим кодоном гена интерферона, которые имеют следующую структуру: § I участок I связывания рибсгсом I промотор. . .GGAGG I ССТСТА( иницкируюцюд кодон А гё...ген Г
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0ТНРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .й АВтОИ:КомУ свиДЕтипьСтву (46) 15.09.90.Бюл. 9 34 (21) 4067724/31-13 .(22) 28.05.86 (71) Институт биоорганической химии им.М.М.Иемякина, Институт вирусологии им.Д.И.Ивановского и Научно-исследо. вательский институт эпидемиологии и микробиологии им:почетного акад.
Н.Ф.Гамалеи (72) В.А.Овчинников, E.Ä.Свердлов, С.AË1àðåâ, С.Г.Арсенян, Г.М.Монастырская, Р.А.Крыкбаев, В.М.Ростапшов, A.Â.×åñãóõèí, А.М.Мелков, Т.В.Виноградова, И.П.Чернов, В.П.Кузнецов, А.С.Новохатский, Ф.И.Ершов и Р;Д.Аспетов (53) 575.224.2, 577.2(048)(088,8) (56) Заявка PCT 1985, С 12 N 15/00, к 85/04186.
„.Я0„„1433019 А 1
1 (51)5 С 12 11 15/00, А 61 К 37/66 (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПДАЗМИПНАЯ ДНК р?РН-ytrp, КОЛИРУИХЧАЯ СИНТЕЗ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО ИММУННОГО ИНТЕРФЕРОНА (57) Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, конкретно к способам получения практически важных белков методом микро-. биологического синтеза. Целью изобретения является увеличение выхода иммунного интерферона. Увеличение выхода интерферона обеспечивается наличием в плазмиде синтетического участка связывания рибосом и последовательности, расположенной между ним и индуцирующим кодоном гена интерферона, которые имеют следукицую структуру: ! участок 1 инициируюцы
I. связывания! кодон рибосом I
I ° ,АТС...ген промотор...GGAGG. ICCTCTAC
1 1433019 2
Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, конкретно к способам получения практически важных белков методом микро-. биологического синтеза.
Целью изобретения является увеличение выхода иммунного иитерферона.
Увеличение выхода интерферона, обеспечивается наличием в плазмиде 10 синтетического участка связывания рибосом и последовательности расЭ, положенной между ним и иниципрующим
;:.кодоном гена интерферона, которые имеют следующую структуру: 15 участок 1 1инициирукиций связывания
I кодон ! рибосом .I промотор...GGAGG 1CCTCTAC (ATC ... ген
Изобретение иллюстрируется следукицими примерами..
Пример 1. Конструирование рекомбинантной плаэмиды рХРК-ytrp 1.
Последовательность, кодирующую ген иммунного интерферона, получают путем 25 . обратной транскрипции м-РНК, выделенной иэ индуцированных стафилококковым энтеротоксином лнмфоцитов периферичес кой . крови и селезенок человека.
Для осуществления экспрессии зре- 30 лого интерферона в клетках E.coli ! в полученной последовательности удаляют с помощью эндонуклеазы рестрик.ции EcoRII участок, кодирующий сигнальный пептид и заменяют его HB сии> тетический участок, содержащий коды недостающих аминокислот, иницйирующий кодон АТС рибосомсвяэывающий участок и прилегающую к нему последовательность. 40
Для этой цели 5 мкг выделенного
РвСТ фрагмента, содержащего ген незрелого иммунного интерферона, обрабатывают 5 ед, рестриктазы Е соВ II в растворе, содержащем 10 мИ трис-НС1 (pH 7,5), 10 мИ MgClg 10 мИВТТ. Больпшй фрагмент выделяют элюцией из
1F -ной низкоплавкой агароэы после электрофореза в трис-ацетатном буфере.
Х 1 мкг полученного фрагмента до50 бавляют 0,1 мкг синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, полученных путем химического синтеза, 2 мкг выделенного электроэлюцией большого, EcoRI-PstI фрагмента pBR 322 с триптофановым промотором и лидируют в присутствии .10 ед ДНЕ"лигазы фага Т4 в растворе, содержащем 0,5 мМ ATP и, буФер, состав которого был приведен вьппе .
Лнгазной смесью трансформируют компетентные клетки Е,coli К12, которые высевают на чашки, содержащие
ЬВ- агар с тетрацикли ом. Из полученных клонов выделяют плаэмиды и структура встроенных генов подтверждается рестриктным анализом н спквенсом.
Полученную генно-инженерную конструкцию анализируют по эффективности синтеза иммунного интерферона после трансформации клеток Е.cali по антивирусному действию ннтерферона на культуре клеток.
Для этих целей полученные клоны наращивают в 3 мл 1.В-среды в течение ночи в присутствии 15 мкг/мл тетрациклина и затем высевают в 100 мл среды 119, содержащей каэаминовые кислоты и р-èíäoëèëàêðèëoâóþ кислоту (50 мкг/мл) и доращивают до плотности 00 gpss = 1. Полученную биомассу центрифугируют и лизируют,отбираюталиквоты в них определяют активность ин. терферона,как было описано выше.
Для определения уровня синтеза интерферона биомассу центрифугируют и лизнруют в присутствии SDS, отбирают аликвоты, наносят на SDS-содержащий полиакриламидный гель и подвергают электрофорезу. Гель прокрашивают "Кумасси R — 250" и сканируют. По результатам сканирования интерферон составляет 35Х от суммарного белка бактерий.
Пример 2. Конструирование рекомбинантной плаэмиды pIFN-ytrp2. Все операции выполняют как в примере 1, но вместо синтетических последовательностей, используют синтетическую последовательность GGAGG CCTCTAG. Для отщепления сигнального пептида в описанной в примере 1 реакционной смеси импользуют вместо зндонуклеазы
EcoRII рестриктаэу Ava II в том же количестве. Дальнейшие операции идентичны примеру 1.
По результатам сканирования прокрашенных "Еумасси R-250" гелей выход интерферона составляет 35Х от суммарного белка бактерий.
Таким образом, предлагаемое изобретение позволяет увеличить зффективность синтеза иммунного интерферона человека бактериальными клетками по сравнению с прототипом
Положительный эффект достигается за счет использования химически
14334", 19 -.Формула изобретения
Составитель Т. Забойкина
Техред Л.Сердюкова Корректор И. Куска
Редактор А. Кондрахина.3ак аэ 33 25 Тираж 519 Подписное
BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Иосквв, Д-35, Рвуисквя нво., д. 4/5.
Проивводсткенко-попнтрефнееское предприятие, т ; Уптород, уп. Проектная, 4 синтезированного участка связывания рибосон и прилегиОщего к нему участка
ДНК, отличающихся по своей структуре от соответствующих участков, использованных в прототипе.
Преимущество предлагаемого изобретения по сравнения с прототипом зак- . лючается в увеличении выхода интерферона в 1е2"1,8 раза при синтезе его 1п бактериальными клетками.
Рекомбинантная плаэмидная ДИК
pIFN- trp„ кодирующая синтез челове15 ческого иммунного интерферона, размером 4,3 тыс. пяову содержащая, -PstI-EcoRI большой фрагмент векторной плазмиды pBR 322 длиной 3609 п.о.<
- ген зрелого иммунного интерферона человека; фрагмент триптофанового промотора длиной 216 п.o.; синтетнческ ;-й участок связывания рнбосом и последовательность, расположеннап между ннм и инициирующим кодоном гена иптерферона, со следующей струк-. турой: . учасгок 1 связывани51, 1ивицнирующий рибосом 1 1. кодон промотор...ССАСС ССТСТАС АТС...ген1 — в качестве генетического маркера—
Тс -ген устойчивости к тетрациклину, t — участки расщепления уникальными эндонуклеаэами рестрикции,- расположенные на следующих расстояниях в п.о. от dE coRI сейте; Bam НХ вЂ” 3755
Sal Х - 651, Pvu II — 2066, Pst Х—
3609, EcoRI — 4079; — участки узнавания другими эндо-нулеаэами рестрикции, расположенные на следующих расстояниях в п.о. от
dEcoRI — сайта: Accl — 651 h 2246,
