Способ определения оксидоредуктазной активности ферментов и иммуноферментных конъюгатов

 

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к технике проведения ферментативного анализа, может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтической промышленности , а также в биотехнологии и постановке биохимических экспериментов. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа определёняя оксидоредуктаз , а также увеличение его чувствительности . Способ заключается в том, что для определения оксидоредуктазной активности ферментов, а также иммуноферментных конъюгатов проводят инкубацию анализируемого фремента в присутствии субстратов, один из которых является электронодонорным соединением, реагирующим с галоидными солями серебра . фотоматериала , т.е. в качестве субстрата используют разные соединения, являющиеся проявителями. Измерение концентрации такого субстрата в ходе ферментативной реакции проводят с помощью предварительно засвеченного фотоматериала, определяя интенсивность затемнения фотоматериала после нанесения образца и сопоставляя ее с градуировочным графиком . Способ позволяет использовать засвеченный фотоматериал. Применение способа ускоряет определение активности оксидоредуктаз в 20- 40 раз и увеличивает его чувствительность в 10-20 раз. (Л 4 О9 СО ел о ф

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 " 01 1 1 33 50

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4166702/31-13 (22) 24.12.86 (46) 23.11.88. Бюл. Р 43 (71) Самаркандский медицинский институт им. акад. И.П. Павлова (72) Д.М. Аронбаев, В.И. Криворучко, N.Â. Симонова, Н.И. Аронбаева и Д.С. Варфоломеев (53) 577.15(088.8) (56) B$6rkstein F.A. Kinetic study

of horse radish pегоxidase catolyred

oxidation of iodide — Eur. J. Biochem. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОКСИДОРЕДУКТАЗНОИ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ И ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ КОНЪ10ГАТОВ (57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к технике проведения ферментативного анализа, может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтической промышленности, а также в биотехнологии и постановке биохимических экспериментов.

Цель изобретения — ускорение и упрощение способа определения оксидо, SU 3439506 А1 редуктаз, а также увеличение его чувствительности. Способ заключается в том, что для определения оксидоредуктазной активности ферментов, а также иммуноферментных конъюгатов проводят инкубацию анализируемого фремента в присутствии субстратов, один из которых является электронодонорным соединением, реагирующим с галоидными солями серебра ." фотоматериала, т.е. в качестве субстрата используют разные соединения, являющиеся проявителями. Измерение концентрации такого субстрата s ходе ферментативной реакции проводят с помощью предварительно засвеченного фотоматериала, определяя ,интенсивность затемнения фотоматериала после нанесения образца и сопоставляя ее с градуировочным графиком. Способ позволяет испольэовать засвеченный фотоматериал. Применение способа ускоряет определение активности оксидоредуктаз в 20-

40 раз и увеличивает его чувствительность в 10-20 раз.

1 1439506 2

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в медицине, сельском хозяйстве, химической, пищевой и фармацевтиче5 ской промышленности, а также в биотехнологии и постановке биохимических экспериментов.

Цель изобретения — упрощение и ускорение метода определения окси- 10 доредуктаз, а также увеличение его чувствительности.

Способ заключается в том, что для определения оксидоредуктазной актив-. ности ферментов, а также иммуноферментных конъюгатов проводят инкубацию анализируемого фермента в присутствии субстратов, один из которых является электронодонорным соединением, реагирующим с галоидными .солями серебра фотоматериала. Измерение концентрации субстрата донора. электронов проводя-. с помощью гредварительно засвеченного фотоматериала, определяя интенсивность затемнения фотоматериала после нанесения образца и сопоставляя ее с градуировочным графиком.

В качестве субстратов можно использовать разнообразные электронодонорные соединения, реагирующие с галоидными солями серебра фотоматериалы, т.е. с веществами, являющимися проявителями. Применение способа ускоряет определение активности в 20 — 40 раз, упрощает процесс и увеличивает его чувствительность в 10-20 раз (or ?040 до 2 нг/мл)

Пример 1. Определение активности пероксидаэы. 40

В качестве субстратной смеси в пероксидазной реакции используют проявитель ПФ (фенидон-Гидрокннон) предва рительно разбавленный в 10 раз фосфатным буфером рН 7,4. Пероксидазосодержащие растворы готовят на фоне проявителя. По 0,1 мл фермент-су6стратной смеси смешивают в лунках полистироловых планшетов с 0,1 мл

10 " М перекиси водорода. Через 30 мин по 0,02 мл смеси наносят на поверхность фотопластинки. Капли на фотопластинке оставляют на 3-5 мин, стряхивают и пластинку промывают водой.

Закрепление изображения проводят в растворе тиосульфата натрия. Полученные на фотопластинке темные пятна фотометрируют на микрофотометре МФ-4, используя шкалу почернений, и сравнивают с полученным градуировочным графиком, который строят в координатах S (почернения) — lgC (концентрация пероксидазы, нг/мл), Интенсивность почернений обратно пропорциональная концентрации пероксидазы.

Диапазон определяемых концентраций пероксицаэы 3000-3 нг/мл. Предел обнаружения 2 нг/мл °

Пример 2. Определение активности иммунопероксидаэных конъюгатов, Метод основан на изменении концент. рации гидрохинона, входящего в состав проявителя при каталити еском воздействии на него перекиси водорода в прис утствии иммунопе рок сида з ног о коньюгата.

Несколько кристалликов лиофилизированного иммунопероксидазного коньюгата для иммуноферментного анализа:аспарагиназапероксидаэа и иммуноноглобулин G осла против иммунноглобулина G кролика, меченый пероксидазой (конъюгат для прямого конкурентного ИФА и ИФА с использованием вторых антител соответственно) растворяют в физиологическом растворе.

Концентрацию белка определяют на спектрофотометре с использованием номограмм при длинах волн М = 260 нм и 3 = 280 нм. Концентрацию пероксидазы рассчитывают по формуле С вЂ” 0,44 А мг/мл, где А — оптическая плотность раствора при Л = 403 нм.

Полученные растворы конъюгата разбавляют в проявителе ПФ.

Разведения проводят в лунках полистироловых микроплат для юлмунологических реакций, получая 11 разведения (одна лунка оставляется для фоновой реакции„ не содержащей пероксидазу) В соседний ряд лунок заливают стандартные концентрации пероксидазы, приготовленные из лиофии лизированного препарата фирмы Beanal", RZ = 0,6. Инициируют реакцию добавлением 0,1 мл 0,001 М раствора перекиси водорода. Через 20 мин по 0,02 мл раствора из лунок планшета наносят на поверхность засвеченного фотоматериала. Интенсивность полученных почернений сравнивают с почернениями соответствующими различным концентрациям нативной пероксидаэы. Отношение концентрации пероксипазы (с учетом разведения) к общей концентрации белка позволяет судить о пригодности иммунных конь1/ !0!06

Формула и з о б р е т е н и я

Диапазон определяемых содержаний глюкозы 100-0,2 мМоль. Минимально определяемая концентрация глюкозы 2 мг7. (.-О,! мМоль/л), что соответствует клинически значимым концентрациям.

Составитель В. Мурснец

Техред A.Еравчук

Корректор С. Черни

Редактор В. Данко

Заказ 6071/44

Тираж 847 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул, Проектная, 4 югатов для иммуноферментного анализа.

Пример 3. Определение (глюкозы или активности глюкозооксидазы).

Из свежевозогнанного бензхинона гбтовят 0,1 М раствор в 0,05 М фссфатном буфере рН 7,4. На фоне приготовленного раствора растворяют глюкозооксидазу 10 М. Ло О,! мл этой смеси смешивают в лунках полистироловых планшетов для иммунологических реакций с О,! мл глюкозосодержащим раствором. После 30-ми— нутной экспозиции по 0,02 мл смеси, содержащей продукт ферментативной реакции — гидрохинон, наносят с помощью автоматической микропипетки на поверхность засвеченной полоски фотоматериала (фотопластинка, фото— бумага или фотопленка). При появлении на фотопластинке темных пятен интенсивность которых достаточна для фотометрирования, фотопластинку промывают водой и фиксируют в растворе тиосульфата натрия обычным спо— собом. Интенсивность пятен определя— ют на микрофотометре МФ-4 и полученные величины сравнивают с градуировочным графиком, построенным с известными концентрациями глюкозы на той же фотопластинке.

В качестве субстратов в реакции определения онспдоредукта3 могут быть использованьIне только гидроГ хинсн, но и другие злектронодонорные соединения: катехол, резерцинол, р-крезол, пирогаллол, фенол, о-фенилендиамин, р-фенилендиамин, ферроцианид, аскорбат, индолеацетат, которые, как известно, используются в фотографии при проявлении, дублении и усилении изображения.

Таким образом, изображение позволяет значительно ускорить процесс

15 определения активности оксидоредук-таз по сравнению с известным способом — 20-30 мин вместо 10-24 ч, упростить ere (за счет использования засвеченных фотоматериалов и

2р проведение определения на свету), а также увеличить чувствительность определения — 2 вместо 20-30 нг/мл.

25 Способ определения оксидоредуктазной активности ферментов и иммуноферментных конъюгатов, включающий инкубацию ферментсодержащих препаратов в присутствии субстратов и изЗо мерение концентрации одного из субстратов с помощью фоточувствительных материалов, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью ускорения и упрощения способа и увеличения его чувствительности, B качестве оцного иэ субстратов используют злектронодонорные соединен.:,, реагирующие с галоидными солями серебра фотоматериала, а фоточувствительный материал предва10 рительнс засвечивают.