Способ определения состояния фибринолитической системы крови

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным функциональным методам диагностики нарушений гемостаза ,в частности, фибринолиза. Целью изобретения является повышение точности способа. Способ заключается в том, что исследуемую плазму дефибринируют, затем получают эуглобулины, не содержащие фибриногена и лишенные активности С<SB POS="POST">1</SB>-ингибитора, и активируют их каолином. Определение времени лизиса ведут при добавлении к контрольным эуглобулинам активированных эуглобулинов из дефибринированной плазмы. Удлинение времени лизиса более 45 мин свидетельствует о депрессии фибринолиза, а укорочение менее 35 мин - об активации фибринолиза. При тромбозах и синдромах ДВС время лизиса часто удлиняется до 70-80 мин.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 G О1 N 33/86

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4189215/29-14 (22) 30.01,87 (46) 07.07.89. Бил. № 25 (71) Ал1айский государственный медиципский институт им. Ленинского комсомола (72) В.А.Елыкомов и В.В.Усынин (53) 612.015 .(088.8) о(56) Метод исследования XIIa-калли-креин-зависимого лизиса цо Г,Ф.Еремину и A.Т.Архипову. Руководство Io гематологии./Под ред. A,È.Âîðná) åíà, 1985, т.2.с.176. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ

ФИБРИНОЛИТИЧЕСКО11 СИСТЕМЫ КРОВИ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторным функциональным,методам диагностики нарушений е

Изобретение относится к медицине, а именно к области лабораторных методов диагностики нарушений системы гемостаза, в частности фибринолиза.

Из известных способов исследования фибринолиза наиболее близким по технической сущности является метод исследования XIIa-калликреин-зависимого лизиса по Г .Ф.Еремину и

А.Г.Архипову. Для его осуществления используют следукщие реактивы: 3,87.— ный раствор цитрата натрия, 1%-ная уксусная кислота, буфер Миха элиса (рН 7, 47,6), суспензия каолина (5 мг/мл)

0,2773-ный раствор хлорида кальция, дистиллированная вода.

Ход определения: и< лучан т бедную тромбоцитами плаэму н ;ел< нцнх мцнц— мальной контактной актива)ц)и 1бл«<„„SU„„1492287 А 1

2 гемостаза, в частности фибринолиза

Целью изобретения является повышение, точности. способа. Способ заключается в том, что исследуемую плазму дефибринируют, затем получают эуглобулины, не содержащие фибриногена и лишенные активности С,-ингибитора и активируют их каолином. Определение времени лизиса ведут при добавлении к контрольным эуглобулинам активированных эуглобулинон из дефибриниронаиной плазмы. Удлинение нремени лизиса n ee 45 HH naH eTe )<..)a < T n депрессии фибринолиза, а укорочение менее 35 мин — об активации фибринс лиза. При тррмбозах и синдромах ДВС время лизиса часто удлиняется до

70-80 мин. 5 табл. ным способом. В процессе выделения эуглобулиновой фракции, фактор ХГГ подвергают контактной активации каолином, образуется комплекс ф.XIIaвысокомолекулярной кининоген-прекалликреин, который активирует плазминоген. Полученные эуглобулины, содержащие плазмин, растворяют н Gyфере Михаэлиса, и сразу после доба<в лення хлорида кальция засекают врсгнн по секундомеру. В норме полный лпзис происходит за 4-12 мин. Задерж).i лизиса свидетельствует .о недостат ности внутреннего XTIa-эанисцмог< л< ханизма фибринолиза °

11ель изобретения — повлииение ности способа.

Цель достигается T(ì, что н <-.)< собе оценки фибринолиэа, вкличаии:-.<

1492287 получение активированных каолином эуглобулинов, активированные эуглобулины получают иэ исследуемой плазмы после ее дефибринации при 56-57 С о в течение 5-10 мин, затем определяют

1 фибринолитическую активность смеси растворенных активированных эуглобулинов исследуемого и неактивированных каолином эуглобулинов, полученных из пула плазм здоровых людей, взятых в равных количествах, вызывая образование сгустка добавлением хлорида кальция, причем при. времени лиэиса свыше 45 мин диагностируют депрессию фибринолиза, а при времени лизиса менее 35 мин — актнвацию фибринолиза.

45

Способ осуществляют следующим образом.

Реактины используют те же, что и в известном способе.

Бедную тромбоцитами плазму, полученную в условиях минимальной контактной активации, прогревают в те- 25 чение 5-10 мин при 56-57 С, затем центрифугируют при 1200-1400 g н течение 15 мин. Осадок удаляют. Полученный дефибринат инкубируют с каолином при разведении в 16 раз н кислой среде (рН 5,0). Это приводит к

) выпадению эуглобулинов, содержащих плазмин. Смесь центрифугируют при

400 g в течение 6 мин, надосадочную жидкость сливают и растворяют осадок

35 в буфере Михаэлиса (количество буфера равно количеству взятого дефибрината).

В качестве субстрата используют эуглобулины из пула плазм 10 здоровых людей, полученные обычным спо- 40 собом (по Kowarzik): 0,5 мл плазмы вносят н 8,0 мл дистиллированной воды с 0,18 мл 1Х-ной уксусной кислоты, смесь никубируют 30 мин при 4 С и о центрж.>угируют при 400 8 в течение

6 мин. Надосадочную жидкость сливают, а эуглобулины растворяют в 0,5 мл буфера Михаэлиса.

Берут 0,25 мл активированных эуглобулинов из дефибриронаииой плазмы исследуемого и 0,25 мл субстрата, смешивают их в водной пробирке, смесь свертывают 0,5 мл СаС1 (0,2777) и включают секундомер., Засекается время лиэиса образовавшего55 ся сгустка. Исследование проводится о на водяной бане при 37 Г.

У здоровых людей полный лизис происходит за 35-45 мин. Удлинение нремени лизиса свидетельствует о снижении фибринолитической активности плазмы, Так, при тромбозах и синдромах J1HC время лизиса часто удлиняется до 70-80 мин.

Клиническая апробация способа оценки фибрииолиза была проведена у

14 здоровых людей, у 9 больных с массивными ненозными тромбозами, у 6 больных с синдромом ДВС.

Результаты представлены в табл.1.

Иэ представленных данных видно, что при тромбоэах и синдромах ДВС нремя лизиса удлиняется в 1,5 раза, во всех случаях время лизиса превышает 45 мин (M + 28) .

Для ныяснения воэможности регистрации актинации фибринолиза проведена серия экспериментов с добавлением разных концентраций стрептокиназы в плазму (препарат фирмы VEB

ABZNEIMITTELWERX DRESDEN "Awelysin").

Использовались концентрации стрептокиназы, применяемые для лечения больных с тромбоэами.

Результаты (средние данные иэ трех серий экспериментов) приведены н табл.2.

Из представленных н табл.2 данных видно, что исследование фибринолиза предлагаемым способом позволяет выявить степень . активации фибринолиза, время лиэиса менее 35 мин (11+24), тогда как исследование по известному способу в этих условиях невозможно.

Для определения оптимального режима прогревания с целью последующего исследования фибринолиза приведена серия экспериментов по определении зависимости времени лизиса по предлагаемому способу у здороных людей от температуры и времени дефибринации плазмы.

Результаты представлены в табл.3.

Из табл. 3 видно, что оптимальное время дефибринации для предлагаемого способа 5-10 мин при 56-57 С. Дальнейшее прогревание приводит к значительному удлинению времени лиэиса, Пример 1. Больной В., 35 лет.

Диагноз: хронический миелолейкоз, терминальная стадия, ДВС-синдром, гематома нижней трети правой голени.

Результаты лабораторного исследования системы гемостаза: аутокоагуляци. онный тест (АКТ) на 10 мин — 1Ос; каолин-кефалиноное время свертывания (ККВС) 47с (контроль 47с);!

492287

1

Время лиэиса„ мин

Больные

0,66

2,0

2,9

Таблица 2

Время лизиса, мин, при добавлении стрептокиназы в доза, ед/мл

Способ

Время лизиса, на контроле,мин

1О 50 70 IOO 300

30 20 . 15 9 6

Предлагаемый

Известный

СгусСгус- Сгусток ток не не об-обрараэо- зовался вался

Сгус- Сгусток не ток не образо-обравался эовалток не образовал ся ся протромбиновое время 23с (контроль

I7c); тромбиновое время 14с (контроль 15с); этаноловый тест положительный; протаминсульфатный тест положительный.

Изменения компонентов системы гемостаза, участвующих в функционировании фибринолиза> представлены в табл.4.

Иэ табл.4 видно, что время лиэиса в известном способе и предлагаемом удлинено вследствие снижения количества плазминогена, BMK и ПК. Количество фибриногена у больного было нормальным. В данном случае результаты исследования по предлагаемому способу и:известном совпадают.

Вместе с тем, удлинение времени лизиса по .известному способу на 2300.. не- 20 адекватно, так как явно превышает во много раз степень снижения основных компонентов, принимающих участие в регуляции фибринолиэа. Нарушение фибринолиза, выявленное с помощью предлагаемого способа, соответствует степени снижения этих компонентов.

Пример 2. Больная !Ч., 65 лет.

Диагноз: правосторонний илеофеморальный тромбоз.

Результаты лабораторного исследования систем гемоста;a: АКТ на 10 мин

8 с, ККВС 40 с (контроль 46 с) протромбиновое время 18 с,(контроль

17 с), тромбиновое время 14 с (конт35 роль 16 с), этаноловый тест положительный, протаминсульфатный тест положительный.

Изменения компонентов системы гемостаза, участвующих в функциони- 40 ровании фибринолиза, приведены в табл.5.

В данном случае удлинение времени лизиса по известному способу было ложным и обусловлено гиперфибриногенемией. Определение фибринолиза предлагаемым способом не выявило его нарушения, что соответствовало нормальному содержанию ВМК, ПК и плазминогена.

Формула и э о б р е т е н и я

Способ определения состояния, фибринолитической системы крови путем получения плазмы крови, обработки ее каолином, отделением эуглобулиновой фракции, добавления к ней раствора хлористого кальция и регистрации времени лиэиса образовавшегося сгустка, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, плазму предварительно нагревают в течение 5-10 мин при 5657 С, перед добавлением хлористого кальция эуглобулиновую фракцию смешивают в соотношении I:1 с фракцией эуглобулинов, неактивированных каолином и полученных из плазмы крови доноров, при этом при времени лизиса сгустка менее 35 мин определяют активацию, а более 45 мин — депрессию фибринолитической системы.

Т а б л и ц а 1

Здоровые 40,3 2,46

С тромбоэами 69,6 6,1

С синдромом ДВС 71 0 8,2

1492287

Таблиц а 3

Время лизиса при времени прогревания1 мин

5 IO 20

41 42 72

101 124 147

Показатель

Значения показателей

У боль- Контроль,,Процент ного В.В. мин сдвига,X мин

2300

120

40,3

0,214 0,530

82

34

100

2,9

3,4

3,5

Значения показателей

Показатель

У больной Контроль, Процент

111.Е,,мин мин сдвига,X

490

Время лизиса по предлагаемому способу 38

ВМК, мкг/мл 0,435

ПК, мкМоль ВЛМЭ/гг/м ш 119

l 00

Количество Либриног ена,г/л

3,4

121

7,5

Температура дефиб ринации, С

56-57

59-60

Время лизиса по известному способу

Время лизиса по предлагаемому способу

Высокомолекулярный кининоген, ВМК

Плазменный прекалликреин, IIK, м кМоль

BAN3/л/мин

Резерв плазминоге" на,X

Количество фибриногена, г/л

Время лизиса по известному способу

Резерв ппазмииогена, X

Т а б л и ц а 4

Таблица 5

40,3 4

0,530 19

82 43