Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l - продуцент моноклонального антитела к пирофосфатазе еsснеviнiа coli

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания иммуноферментного анализа на основе комплекса пирофосфатаза-антипирофосфатаза. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемыхклеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к пирофосфатазе Eseherihia colt. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ва1Ь/с, иммунизированных препаратом пирофосфатазы Е.соИ. с клетками миелом.ы мыши Р3х63-Ад8.653. Клетки культивируют в среде ШОМ (модифицированная Исковым среда Дульбекко) с добавлением 10%- ной эмбриональной телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5% СОа. Штамм обозначен PFB1 и депонирован под номером ВСКК(П) 4220. Штамм продуцирует моноклрнальное антитело IgCI изотипа, связывающееся с пиг рофосфатазой Е.соП. СодержаниеМКА'В 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитнрй жидкости составляет соответственно 11-12 мкг и 4-5 мг. МКА могут быть использованы для создания иммуноферментного анализа на основе комплекса пирофосфатаза-антипиро.фосфатаза. 2 табл.•

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ии

5н ъи

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.

1 (2 1) 4843245/13 (22) 27.06,90 (46) 15.02,92. бюл. N..6 (71) белорусский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) И.К.Фомин, Н.В.Петевка и А.В вПанютич, 4 (53) 591.111.8 (088.8) (56) Аналогов в научно-технической и патентной литературе не обнаружено. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕ.МЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ, MUS

MUSCULUS L-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТЕЛА К ПИРОФОСФАТА.ЗЕ Е$СНЕЮН!А COLI (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для создания иммуноферментного анализа. на основе комплекса пирофосфатаза-антипирофосфатаза. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для поставовки иммуноферментного анализа (ИФА).с пирофосфатэзой в качестве. индикаторного фермента. .Целью изобретения является получение гибридного штамма, продуцирующего мо-. ноклональные антитела (МКА) к пирофосфа. тазе Е.coll, пригодные для создания иммуноферментного анализа на основе комплекса пирофосфатаза-антипирофосфа. таза.

Штамм получают следующим образом;

Мышей линии Balb/с иммунизируют по двухнедельной схеме 50 мкг пирофосфвта„„ Ж„„1712412 А1 (si)s С 12 N 5/00, А 61 К 39/395 клеток мыши, продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к пирофосфатазе

Escherihla coll.: Штамм получают гибриди.зацией спленоцитов мышей линии Balb/c. иммунизированных препаратом пирофосфатазы Е.coll, c клетками миеломы мыши

Р3х63-Ag8.653. Клетки культивируют в среде 1MDM (модифи цирован ная Исковым среда Дульбекко) с добавлением 10%ной эмбриональной телячьей сыворотки при

37 С в атмосфере 5% COz. Штамм обозначен

PFB1 и депонирован под номером ВСКК(П) 4220. Штамм продуцирует моноклонааьное антитело IgCI изотипа:, связы вающееся с пи-. рофосфатазой Е.соИ. Содержание М КА.в 1 мл культуральной среды и 1 мл асцитнай жидкости составляет соответственно 11-12 мкг и 4 — 5 мг. МКА могут быть использованы для создания иммуноферментного анализа на основе комплекса пирофосфатаэа-антипирофосфатаза. 2 табл. зы Е.соИ в 0,15 М NaCI,в сМеси с равным объемом полного адьюванта Фрвйнда дважды вводят внутрибрюшинно с интервалом в 7 дней. За 3, 2 и 1 день до слияния ЬЭ

25 мкг пирофосфатазы Е.coll вводят внутрибрюшинно в 0,б ии 0,10 M NaCI. Гибридивв. ) в цию 1,2.10 клеток селезенки иммунных, д в мышей и 3 107 клеток миеломы мыши

РЗХ63 Ag8.653 проводят 50%-ным. раствором полиэтиленгликоля мол.м. 4000, содержащего 5% диметилсульфоксида, в течение

1,5 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полиэтиленгликоля, клетки высевают в 96-луночные панели по 2 10 спленоцитов

5 в лунку. Для селекции гибридом используют

1712412 среду 1MDM (модифицированная Исковым среда Дульбекко) с добавлением 10 j эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 10 М гипоксантина, 4 10 М аминоптери-7. на и 1,6.105 М тимидина; Гибриды-продуценты клонируют 2 раза методом конечных разведений, высевая по 1 клетке в лунку.

После 2 клонирований практически 100% субклонов продуцируют MKA к пирофосфатазе Е,coll. Продукция антитела сохраняется как минимум в течение 15 пассажей в культуре.

Специфичность взаимодействия МКА с .. пирофосфатазой Е. со П вы я вля ют методом

ИФА.

Штамм обозначают PFBI. Штамм PFBI хранится в Специализированной коллекции

- перевиваемых соматических клеток животных Института цитологии АН СССР под номером ВСКК/П/442Д и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки.

Среда для культивирования — 1МОМ с

10 ЭТС, 2 мМ глутамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 MM меркаптоэтанола. Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5% СО2. Посевная доза 2 10 клеток в мл.

Для выращивания гибридомного штамма в асцитной форме пригодны мыши

Balb/c. Мышам за 7 — 30 дней до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по

0,5 MR пристана. Клетки инъецируют внутрибрюшинно по 2 — 5 миллионов в 0,5 мл среды

1MDM. Асцит формируется через 12 — 14 дней.

Продуктивность. штамма.

Через 3 — 4 дня концентрация антитела в культуральной жидкости достигает 11 — 12 мкг/мл. Концентрация антитела в асцитной жидкости достигает 4 — 5 мг/мл. Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует моноклональные антитела 1gG1.

Специфичность — пирофосфатаза Е.cali.

Контаминация. Бактерии и грибки в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды, Заражение микоплазмой не выявЛено по характеру включения тимидиновой метки.

Криоконсервирование. Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10j диметилсульфоксида. Режим замораживания: 1 С в минуту до -70 С.

После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание. на водяной бане при 37 С, Жизнеспособность клеток после размораживания 55-60 по окрашиванию трипановым синим, .

Пример 1, Для определения специфичности взаимодействия МКА с пирофос5 фатазой Е.coll используется метод ИФА.

Козьи антимышиные антитела (Calblochem), разведенные до 0,5 мкгlмл, в 50 мкл 0;1 M карбонатного буфера рН 9,6 вносят в лунки

96-луночных микроплат и сорбировуют ночь

10 при 4 С, После отмывки в лунки вносят по

50 мкл культуральной среды штамма PFBI è параллельно культуральную среду штамма гибридомы 33Б1.2, продуцирующей антитела к липополисахариду E.coll, а также

15 супернатант спленоцитов мыши стимулированных ФГА (фитогемагглютинином) IA

vitro. Панель инкубируют 1 ч при 20ОС, затем отмывают и вносят по 1 мкг на лунку пирофосфатаэы Е,coll в 50 мкл 0,01 M Трис-НС!

20 буфере, рН 7,4, 0,05 М NaCI, 0,05% Твин-20, 0,1 поливинилпирролидона. После инкубации в течение 1 ч при 20 С панель отмывают и в лунки добавляют субстрат— пирофосфат, 30 —,50 мкм в 0,05 М Трис-Hcl

25 буфере, рН 9,0, 0,5 мМ MgClz и инкубируют

20 мин при 37 С, Окрашивание лунок учитывают после добавления раствора, содержащего молибдат аммония и малахитовый зеленый на спектрофотометре при длине

30 волны 620 нм.

Результаты опыта по определению специфичности связывания МКА, продуцируемого клетками штамма PFBI с пирофосфатазой E.coll, представлены в табл.1.

35 Полученные результаты свидетельствуют о высокой специфичности МКА, вырабатываемого клетками штамма PFBI, и показывают возможность использования этих МКА для сорбции пирофосфатазы из

40 раствора с сохранением ее ферментативной активности.

Пример 2. Определение антигена в твердофазном ИФА с применением комп лекса пирофосфатаза-антипирофосфатаза

45 является аналогом ИФА с применением комплекса пероксидаза-антипероксидаза (ПАП-метод).

Антиген, фактор некроза опухоли-а человека(ФНО-а), в концентрациях oi 2 мкгдо

50 20 нгlмл в 100 мкл 0,1 M карбонатного буфера рН 9,6 вносят в лунки 96-луночный микроплат и сорбируют в течение 12 — 18 ч при 4ОС. После отмывки в микроплаты добавляют по 1 00 мкл/лунку 0,01 М Трис-HCI

55 буфера, рН 7,4; 0,05 М NaCI, 0,05 Твин-20, 0,01 поливинилпирролидона и инкубируют 30 мин при 20 С для блокирования мест неспецифической сорбции белков. Этот же буфер применяется для приготовления всехпоследующих реагентов и отмывки. Затем в

1712 412

Таблица 1

Табл и ца 2

Составитель

Техред M. Моргентал

Корректор О, Кундрик

Редактор Ю. Середа

Заказ 510 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, l01 лунки микроплат вносят по 100 мкл мышиных МКА к ФНО-а в концентрации 10 мкг/мл и инкубируют 1 ч при 20 С. Микропла- . ты отмывают, добавляют по 100 мкл/лунку антимышиные антитела (набор для иммуно- 5 диагностики Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР) и инкубируют 1 ч при 20 С. Далее в отмытые .. лунки микроплат в объеме 10 мкл добавляют преформированный комплекс пирофос- 10 фатаза-антипирофосфатаза (20 мкг/мл: пирофосфатазы, 10 мкг/мл МКА к пирофосфатазе) и инкубируют при тех же условиях..

В качестве субстратного раствора добавляют 0,05 M Трис-HCI, рН 9,0, 0,5.мМ MgCtz,. 15 содержащий пирофосфат в концентрации

30-50 мкМ и инкубируют 10-30 мин при

37 С.

В табл.2 представлены, результаты опыта с использовайием набора для имму- 20 . нодиагностики с помощью комплекса пероксидаза-антипероксидаза.

Как видно из данных табл.2 антитела продуцируемые штаммом PFBI, являются.. пригодными для использования их в ИФА 25 на основе комплекса пирофосфатаза-антипирофосфатаза. Чувствительность данного анализа при определении ФНО-а человека. составляют 30 нгlмл. Пирофосфатаза имеет ряд преимуществ по сравнению с другими ферментами; применяющимися в качестве индикаторной метки, а именно цветовой переход в случае пирофосфатазы благоприятен для визуальной оценки и позволяет регистрировать поглощение, превышающее . фоновое всего на 0,1 оптической единицы,, константа Михазлиса, характеризующая пирофосфатазную реакцию на три порядка ниже, чем для реакций пероксидазы и щелочной фосфатазы, что позволяет резко сократить расход субстрата, благодаря высокой термостабильности пирофосфатазы

И ФА можно проводить при температурах до

60 С, что в несколько раз сокращает продолжительность анализа и увеличивает его специфичность.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus 1

В СКК/П/Й442Д-продуцент моноклонэльного антитела к пирофосфатазе Escherlhla соИ.