Способ получения ауксинрецепторного белка из растений

 

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений. Цель изобретения - повышение чистоты выделяемого ауксинрецепторного белка. Данная цель достигается выделением всей суммы растворимых ауксинсвязывающих белков методом аффинной хроматографии на индолилуксусной кислоте - ацетоамидогексилсефарозе и дополнительной очисткой элюанта на гидрофобной колонке с политетрафторэтиленом для выделения индивидуального белка. Ё

союз советских

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s G 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4749876/13 (22) 25.10,89 (46) 23.05.92. Бюл, № 19 (71) Институт биоорганической химии им.

А.С. Садыкова (72) И.А.Маркова, А.К.Тонких, А.В.Карась и

Ш.И,Салихов (53) 581.1 (088,8) (56) Libbenga К.R. et al. Hormones receptor

and cellular interactions in plants.—

Cambridge: Cambridge Univ. press, 1986, р.

1 — 68.

Cuatrecasas P. Advances in enzymology, Interscience. — N.Y., 1972, р, 29 — 38.

Нейрохимия, 1985, т. 4, ¹ 3, с. 260-267.

Селиванкина С.Ю, и др. Физиология растений, 1982, т. 29, вып. 2, с. 274, Nature, 1970, ч. 227., ¹ 5259, р. 680.

Mennes А.M. et al. NATO ASI Series, ч.

10, — Springer Verlag, Berlin-Heldelberg, 1987, р. 51 — 62.

Изобретение относится к биохимии и физиологии растений, а именно к способу получения ауксинрецепторного белка из проростков хлопчатника, который может быть использован для скрининга пестицидов ауксинподобного действия.

Известен способ выделения ауксинсвязывающих белков специфической культуры клеток табака, требующий для своего роста гербицид 2,4 — Д, т.е. 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту, и обогащенный тип ауксинсвязывающих белков, методом аффинной хроматографии на колонке с 5-гидрооксиИ У К-э поксисефа розе (И У К-и ндолилуксусная кислота). B результате был выделен белок с мол.мас. 150 — 200 кД, стимулирую„, Ж„) 1735779 Al (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АУКСИНРЕЦЕПТОРНОГО БЕЛКА ИЗ РАСТЕНИЙ (57) Изобретение относится к биохимии и физиологии растений. Цель изобретения— повышение чистоты выделяемого ауксинрецепторного белка. Данная цель достигается выделением всей суммы растворимых ауксинсвязывающих белков методом аффинной хроматографии на .индолилуксусной кислоте — ацетоамидогексилсефарозе и дополнительной очисткой элюанта на гидрофобной колонке с политетрафторэтиленом для выделения индивидуального белка. щий в присутствии ИУК синтез P HK в экспериментах.

Однако в нативном растении присутствует несколько ИУК-связывающих белков, в связи с чем применение одностадийного выделения не пригодно для получения рецепторного белка в чистом виде. Кроме того, рецептор выделен из специфической мутантной культуры клеток, а не из нативного растения, Сравнительный анализ предлагаемого изобретения с другими техническими решениями показал, что в литературе отсутствуют данные по выделению и характеристике ауксинсвязывающих белков из проростков хлопчатника.

1735779 -нн(Снг(еннг+ (АН -СЕфар ага " СНг0

- -нн(снг1,йн-с=-..

Снгд 0 Н 0

ОН сод ааеяоакааогексалсефарога

СН,С00Н

0 ф-нн(снг1,нн-с:

СН,0(- Ч

3 аодоаевоанидогекоио- Н

СН С00Н

-. НН(СН,НН-V;- -Н,(-НУ о l(НУН-ааетоанадогексилсефарога

q0

Цель изобретения — повышение чистоты выделяемого белка — рецептора индолилуксусной кислоты (ИУК) из проростков хлопчатника.

Поставленная цельдостигается выделе- 5 нием всей суммы растворимых ауксинсвязывающих белков методом аффинной хроматографии на ИУК-ацетамидогексилсефарозе и дополнительной очисткой элюата на гидрофобной колонке с использованием IÎ в качестве адсорбента политетрафторэтилена для выделения индивидуального белка и характеристики его рецепторных свойств.

Пример.

Приготовление водного экстракта. 15

B работе использованы проростки хлопчатника (Gossypium hirsutum L,), сорт

1.75-Ф. Семена обрабатывают концентрированной серной кислотой для снятия опушенности, замачивают в воде 12 ч и 20 проращивают в темноте на влажной фильт- ровальной бумаге при 28 С 2 — 3 сут.

40 г этиолированных проростков измельчают ножницами и гомогенизируют в

10 объемах трис-HCI 50 мМ, рН 7,8, 50 MM 25

KCI, 2,5 мМ MgCIz, 5 мМ ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), 2 мМ дитиотреитола, 250 мМ сахарозы, в гомогенизаторе

Поттера. Гомогенизацию и все операции по выделению проводят при 2 — 4 С. Гомогенизат фильтруют через слой бязи и центрифугируют 30 мин на центрифуге при 20 тыс.д., при этом осаждается фракция грубых мембран.

В супернатант объемом 430 мл добаляют сухой сульфат аммония до 80, насыщения, выдерживают на холоду и осадок собирают центрифугированием при 20000 д. в течение 20 мин. Осадок перерастворяют в 5 мл буфера (50 MM трис-НС!, рН 7,8), нерастворившиеся частички удаляют центрифугированием. Супернатант, содержащий 47,8 мг белка, обессоливают на колонке (50х2,6 см) с седафексом 6-25, уравновешенной 50 MM трис-HCI, рН 7,8, и элируют тем же буфером при скорости 30 мл/ч. Белковую фракцию, выходящую в свободном объеме колонки, используют для дальнейшей работы.

Синтез аффинного сорбента;

Синтез сорбента осуществлен по известной методике. В 120 мл диоксана растворяют 2,79 г йодуксусной кислоты и 2,7 r

N-гидроксисукцинимида, К полученному раствору добавляют 3,7 г N,N-дициклогексилсукцинимида. Через 70 мин выпавший осадок дициклогексилмочевины удаляют фильтрованием, 90 мл фильтрата добавляют к 60 мл суспензии АН-сефарозы, содержащей 10-13 мкМ NHz-групп в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5, добавление ведут при 4 С, Для тестирования экранирования аминогрупп к аликвотам добавляют тринитробензолсульфонат и по исчезновению оранжевой окраски судят об окончании реакции (30 мин). Затем 60 мл йодацетоамидогексилсефарозы переносят на шотовскую воронку и промывают холодным раствором

0,1 М NaCI (2 л). В йодацетоамидный гель вносят раствор ИУК-индолилуксусной кислоты в концентрации 10 М, предварительно растворенную в диметилформамиде и смешанную с 0,1 M раствором КаНСОз (рН

8,5) в соотношении 1:1. Смесь выдерживают в течение 3 сут при комнатной температуре.

В полученную ИУК-ацетоамидогексилсефарозу добавляют 0,2 М раствор 2-аминоэтаиола для маскировки непрореагировавших йодацетильных групп, По окончании реакции (через 24 ч) аффинный сорбент промывают0,1M МаНСОз, рН 8,5(3л). Полученный сорбент содержит 10 мкМ ИУК на 1 мл геля.

Схема получения сорбента следующая;

Выделение ИУК-связывающих белков.

Белковую фракцию, содержащую 33,3 мг белка, наносят на ИУК-ацетоамидогексилсефарозный гель в колонке, размеры которой 10х2,6 см. Аффинную колонку промывают до получения элюата с постоянной оптической плотностью, при 280 нм.

Элюцию связавшихся белков осуществляют

1 M NaCI, при скорости 3 мл/мин. Белковую фракцию диализуют против воды и лиофильно высушивают, Количество белка, связывающегося с ИУК-ацетоамидогексилсефарозным гелем, составляет 4,3 мг, что дает 97 белка от наносимого на колонку, Характеристика ИУК-связывающих белков. ()Оценка рецепторног д связывания, 1735779

Составитель А.Карась

Техред M.Ìoðãåíòàë

Корректор M.Äåì÷èê

Редактор Е.Папп

Заказ 1813 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Эксперименты по связыванию проводят, используя фильтрование на нитроцеллюлозных фильтрах марки "Сымпор" с размером пор 0,4 — 0,8 мкм по известной методике. Связывание с водорастворимыми 5 фракциями проводят в 20 мМ трис-HCI, рН

7,6. При этом используют Н-ИУК с удельной активностью 21 Ки/мМ. Для оценки уровня неспецифического связывания применяют немеченную MYK в концентрации 10 М, 10

Кривые связывания указывают на один тип связывающего участка с Кд = 6 MM и с плотностью связывающих участков 20 пМ/мг белка, 2) Оценка РНК-полимеразной активности. 15

Из проростков хлопчатника выделяют хроматин обычным способом, Для этого проростки хлопчатника гомогенизируют в буфере, содержащем 0,25 М сахарозу, 50 мМ трис-HCI, рН 7,8, 0,1 М М9С!2 и 0,02 M 20

2-меркаптоэтанол. Гомогенат фильтруют через слой нейлоновой сетки и центрифугируют при 1000 д.в течение 10 мин. Осадок, содержащий ядра, ресуспендируют в буфере выделения, содержащего 1 -ный трион- 25

Х-100, дважды промывают буфером того же состава, но без триона и центрифугируют при 20000 д. в течение 20 мин. Осадок растворяют в буфере, содержащем 50 мМ трисHCI, рН 7,8, 0,02 M MgClz, 1 мМ 30

2-меркаптоэтанола и 10 -ный глицерин.

Реакционная смесь для определения

P Н К-полимеразной активности содержит

0,2 мМ АТФ, ГТФ, УТФ и 0,02 мМ Н ЦТФ с 35 удельной активностью 20 Ки/мМ, 0,1 М KCI, 2 мМ ацетата натрия, 20 мМ трис-HCI с рН

7,8, 1 мкг, выделяемого ауксинсвязывающего белка, 10 мкМ ИУК и 20 мкг хроматина.

Реакцию начинают внесением суспензии 40 хроматина, Смесь инкубируют 30 мин при

20 С и останавливают добавлением 50 мкл

10 / -ной трихлоруксусной кислоты. Содер- . жимое пробирок фильтруют на фильтрах

"Сынпор", аналогично эксперименту по свя- 45 зыванию (1 г). Фильтры высушивают, помещают во флаконы со стандартным толуольным сцинтиллятором и измеряют их радиактивность на счетчике "Бета-2".

Выделение гомогенного ИУК-связывающего белка с помощью гидрофобной хроматографии.

Очистку ауксинсвязывающего белка проводят на колонке (12х1 cM) с сорбентом

"Полихром-1". 4,3 мг лиофильно высушен ного белка перерастворяют в 500 мкл буфера трис-H CI 50 мМ с рН, 7,8 и наносят на колонку. Элюцию с колонки проводят этанолом ступенчато: 20 — 40 — 60 — 80 — 96 соответственно. Профиль элюции представлен шестью пиками. Пятый пик, элюируемый

96o ным этанолом, в присутствии ИУК стимулирует PH К-полимеразную активность в препарате хоомати на и специфически связывает Н-ИУК. Получено 0,5 мг белка.

Для оценки молекулярной массы полученного белка, элюат после аффинной колонки разделяют на колонке "Glas Pac. HW — 3000" (8х300 мм) с помощью аппаратуры для высокоэффективной жидкостной хроматографии фирмы LKB. Пик с кажущейся молекулярной массой около 200 кДа, обладает

PHK-полимеразной активностью. Электрофарез в ПААГ с ДДС-натрия, как для этого пика, так и для пятого пика, дает одну полосу, соответствующую мол.массе 43 кДа.

Предлагаемое изобретение позволяет впервые осуществить эффективное выделение ауксинрецепторного белка из нативного растения (хлопчатника), который может быть использован в качестве инструмента при проведении скрининга новых пестицидов ауксинподобного действия.

Формула изобретения

Способ получения ауксинрецепторного белка из растений, включающий получение водного экстракта растений, осаждение белков и очистку ауксинрецепторного белка хроматографическими методами, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения чистоты выделяемого белка, очистку ведут методом аффинной хроматографии с использованием в качестве адсорбента индолилуксусная кислота — ацетоамидогексилсефароза, а затем дополнительно очищают белок методом гидрофобной хроматографии с использованием в качестве адсорбента политетрафторэтилена.