Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости астinомyсеs kurssanovii 93
Изобретение относится к получению ферментов, в частности хитиназ, продуцируемых актиномицетами. Целью изобретения является повышение степени очистки хитиназ. Изобретение заключается в том, что хитиназы (XI, XII, XIII) выделяют непосредственно из культуральной жидкости Actinomyces kurssanovil 93 в две стадии: лигандообменной хроматографией на иминодиуксусной агарозе, заряженной ионами двухвалентной меди, путем ступенчатого понижения рН сначала от 6,0-7,5 до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5 (первая и вторая фракции соответственно). После этого фракции подвергают дополнительной очистке с помощью гидрофобной хроматографии на бутил-Тойоперле в градиенте концентрации сульфата натрия от 1,5-1,0 М до 0, хитиназы вымывают фосфатным буфером, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,1-0,2 М и не содержащим сульфат натрия. Степень очисгки до 25. 2 табл. fe
СОЮЗ СОВЕ ТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4794718/13 (22) 26,09.89 (46) 23,08.92. Бюл. N 31 (71) Институт элементорганических соединений им, А.Н, Несмеянова, Институт биохимии им, А.Н. Баха (72) И.А. Стояченко, B.Ï. Варламов, В.А. Даванков, Н,Я. Кобзева, Н.А. Тиунова и А.M. Безбородов (56) Roberts R.L., Cabib Е, Serratla marcescens chitinase: one-step purification and use for the defermination of chiFin. -Апа!, Blochem„1982, 127, р, 402-412. Авторское свидетельство СССР М 413189, кл. С 12 N 9/26, 1973. (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ХИТИНАЗ ИЗ. КУЛЬТУРАЛ ЬНОЙ ЖИДКОСТИ ACTINOMYCES KURSSANOVl I 93 (57) Изобретение относится к получению ферментов, в частности хитиназ, продуциИзобретение относится к способам выделения и очистки ферментов хроматографией, конкретно к способам выделения хитинаэ иэ Kurssanovli 93. Известен способ выделения хитиназ иэ культуральной жидкости путем сорбции ферментов на хитине с последующим его гидролизом хитиназами. Этот метод привОдит к потере более 60% исходной хитиназной активности и не позволяет разделить ферменты, близкие по сродству к хитину. Наиболее близким к предолженному по технической сущности и достигнутыми результатам является способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Act. KurssanoviI 93 осаждением фермента этиловым спиртом или сульфатом аммония.,. SU„„1756354 А1 руемых актиномицетами. Целью изобретения является повышение степени очистки хитинаэ. Изобретение заключается в том, что хитиназы (XI, XII, XIII) выделяют непосредственно иэ культуральной жидкости ActInomyces kurssanovIi 93 в две стадии; лигандообменной хроматографией на иминодиуксусной агарозе, заряженной ионами двухвалентной меди, путем ступенчатого понижения рН сначала от 6,0 — 7,5 до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5 (первая и вторая фракции соответственно). После этого фракции подвергают дополнительной очистке с помощью гидрофобной хроматографии на бутил-Тойоперле в градиенте концентрации сульфата натрия от 1,5-1,0 М до О, хитиназы вымывают фосфатным буфером, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,1-0,2 М и не содержащим сульфат натрия, Степень очистки до 25. 2 табл. Однако, данный способ не позволяет получать ферменты высокой степени очистки. Активность препарата составляет только 18 — 22 ед!мл. Целью изобретения является повышение степени очистки хитиназ. Способ выделения хитинаэ иэ культуральной жидкости Actlnomyces Kurssanovll заключается в том, что ее наносят на иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди и уравновешенную буфером, создающим рН 6,0-7,5. вымывают балластные белки при рН 6,0 — 7.5. затем последовательно злюируют две фракции белков путем ступенчатого понижения рН сначала до 4.8-5,6, затем до 3,8-4,5, по- . сле чего каждую из двух фракций белков 1756354 40 после доведения в них рН до 6,8 — 7,2, наносят на бутил-Тойаперл 650 M. уравновешенный буфером, создающим рН 6,8-7,2 и содержащим сульфат натрия с концентрацией 1,0-1,5 М, затем примеси первой фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся с 1,0-1,5 до 0,1 М, а хитиназу вымывают фосфатным буфером с концентрацией 0,01-0.02 М, примеси второй фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией. понижающейся с 1,0 — 1,5 до 0,3-0,4 М, хитиназу с мол.м, 26 кДа вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией 0,1 — 0,2 М, хитиназу с Moll,м. 42 кДа вымывают фасфатным буфером с концентрацией 0,01 — 0,02 M. Способ осуществляется следующим образом, На колонку с иминодиуксуснокислой агарозой, заряженной ионами двухвалентной меди и уравновешенной буфером с рН 6,0-7,5, содержащим 0,5-1,0 M хлористого натрия, наносят культуральную жидкость Actlnomyces Kurssanovll 93 в объеме, равном обьему колонки. Элюцию проводят со скоростью 0,8-1,0 мл/мин при ступенчатой смене буферов следующего состава: А — 0,1 М натрий-ацетатный буфер., рН 6,0-7,5, содержащий 0,5-1,0 М хлористого натрия; Б — 0,1 M натрий-ацетатный буфер, рН 4,8-5,6, содержащий 0,5-1,0 M хлористого натрия;  — 0,1 M натрий-ацетатный буфер, рН 3,8-4,5, содержащий 0,5 — 1,0 М хлористого натрия. При этом на колонке не сорбируются,В -М-ацетилглюкозаминидаза, протеазы (80 Д протеазной активности культуральной жидкости) и другие примеси. Белки, обладающие хитиназной активностью по коллоидному хитину, которую оценивают по количеству восстанавливающих сахаров с помощью 3,5динитросалициловой кислоты, элюируют путем ступенчатого понижения рН сначала буфером Б, а затем буфером В (первая и вторая фракции соответственно). В каждой из двух фракций белков доводят рН до 6,8 — 7,2, после чего их наносят на колонку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравнавешейным 0,1 M натрий-фосфатным буфером рН 6,8 — 7,2, содержащим 1,0 — 1„5 M сульфата натрия. Злюцию проводят убывающим градиентом концентрации сульфата натрия, задаваемым автоматическим смесителем в течение 2 ч, со скоростью 0,8-1,0 мл/мий, Начальный буфер: 0,1 М фосфатный буфер, рИ 6,8-7,2, содержащий 1,0-1,5 М сульфата ивтрия, конечный буфер: 0,010,02 M фосфатный буфер, рН 6,8-7,2. Примеси первой фракции элюируют в градиенте концентрации сульфата натрия, хитиназу(Х!) вымывают 0,01-0,02 M фосфатным буфером рН 6,8-7,2, примеси второй фракции вымывают раствором сульфата натрия с концентрацией, понижающейся от 1,0-1,5 да 0,3-0,4 М, хитиназу с мол.м. 26 кДа (Xll) вымывают растворам сульфата натрия с концентрацией 0,1 — 0,2 М, а хитиназу с мол.м, 42 кДа (XII 1) вымывают 0,01-0,02 М фосфатным буфером рН 6,8 — 7,2, не содержащим сульфата натрия. Если иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди, уравновесить буфером, имеющим рН меньше 6,0, и проводить сарбцию белков культуральной жидкости Actinomyces KurssànÜll 93 при этом рН, та хитиназа первой фракции не будет задерживаться на колонке, а будет элюираваться вместе с балластными белками, что исключает ее выделение в индивидуальном виде. Если рН уравновешивающего буфера и буфера А больше 7,5, происходит частичная инактивация ферментов, Если первую фракцию белков вымывать с иминодиуксуснокислой агаразы при рН меньше 4,8, не удается ее полностью отделить от второй фракции, при рН больше 5,6, хитиназа не элюируется с сарбента. Если вторую фракцию белков вымывать с сорбента при рН меньше 3Я, происходит частичная инактивация ферментов, при рН больше 4,5, фракция не элюируется с иминодиуксуснокислай агарозы. Интервал рН 6,8-7,2 соответствует минимуму потерь хитиназной активности, поэтому данный интервал рН использован для хроматаграфической очистки первой и второй фракций белков на бутил-Тойоперле. Уравновешивающий буфер содержит сульфат натрия в концентрации 1,0 — 1,5 M. При меньшей концентрации наблюдается неполная сорбция хитиназ, при более высокой концентрации — высаливание белков. Хитиназа, содержащаяся в первой фракции, элюируется с бутил-Тойоперла в 0,01 — 0,02 М фосфатном буфере. Если проводить элюцию буфером с концентрацией больше 0,02 M или меньше 0,01 М„не произойдет полного элюирования фермента, По аналогичным соображениям выбран интервал концентрации сульфата натрия 0,10,2 М для элюирования хитинази второй фракции. Осуществление способа в обьеме изложенных признаков позволяет получить препараты высокоочищенных ферментов, гомогенных по данным злектрофореза в полиакрил амидном геле в денатурирующих yct 1756354 ловиях, имеющих активность, 0,9 0,02 мкМ!мг млн, (Xl), 1,59 + 0.02 MKM/ì мин (Xli), 5,13 + 0,02 мкМ/мг мик (Xiii), что превышает активность продукта, получаемого по известному способу в 5, 10 и 32 раза соответственно для ферментов Xl, XII и XIII, Иминодиуксуснокислая агароэа, заряженная ионами двухвалентной меди, ранее использовалась для разделения ферментов класса нуклеаз, однако она не 10 использовалась для разделекия карбогидраз, к которым относятся хитиназы; указанная функция носителя не вытекает с очевидностью из его извстных свойств. Пример I. Колонку с иминодиуксуснокислой агарозой заряжают ионами меди промыванием колонки пятью обьемами 0,5 М раствора сульфата меди, уравновешивают 0,1 M натрия — ацетатным буфером рН 6,5, содержащим 0,5 М хлористого натрия На колонку (2,0 - 4,5 см) наносят I5 мл культуральной жидкости. Элюцию проводят со скоростью 0,8 мл/мин при ступекчатой смене буфером следующего состава; А — О 1 М натрий-ацетатный буфер, рН б,=. содержащий 0,5 М хлористого натрия; Б — О, I М натрий-ацетатный буфер, рН 5,0, содержащий 0,5 М хлористого натрия,  — 0,1 M натрий-ацетатный буфер, рН 4,0, содержащий 0,5 M хлористого натрия, обьем фракций 4 мл. Хитиназкая активность была обнаружена во фракциях белков, элюирующихся буферами Б и В. Каждую из этих фракций после доведения рН до 7,0 наносят на коланку с бутил-Тойоперлом 650 М, уравновешекную 0,1 М натрий-фасфаткым буфером рН 7,0, содержащим 1„0 М сульфата натрия. Размер колонки (2,5 х 7,5 см), наносят 16 оптическлх единиц(280 км). Элюцию nðoâo- 40 дят линейным градиентом сульфата натрия от 1,0 до 0 М, задаваемым автоматическим смесителем Ультраград, со скоростью 0,8 мл/мин в ечение 2 ч. Начальный буфер: 0.1 M натрии-фосфатный, рН 7,0, содержащий 45 1,0 M сульфата натрия; конечный буфер: 0,02 M натрий-фосфатный, рН 7,0. После этого колонку промывают конечным буфером. Пример 2-9, Способ осуществляется аналогично примеру 1. Режимы его проведения представлены в табл.1, активность полученного продукта проведена в табл, 2. Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить степень очистки хитиназ Xi, Х!I, XIII из культуральной жидкости Actlnomyces KurssanovIi 93 в 5, 10 и 32 раза соответственно, Формула изобретения Способ выделения хитиназ из культуральной жидкости Actinomyces Kurssanovli 93, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки хитиназ, культуральную жидкость наносят на иминодиуксуснокислую агарозу, заряженную ионами двухвалентной меди и уравновешенную 0,1 М натрий-ацетатным буфером рН 6,0 — 7,5, содержащим хлористый натрий, отмывают балластные белки,, затем последовательно элюируют две фракции белков путем ступенчатого понижения рН сначала до 4,8-5,6, затем до 3,8-4,5, в каждой из двух фракций доводят рН до 6,8-7,2, после чего наносят их на бутил-тойоперл 650 М, уравновешенный 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 6,8 — 7,2, содержащим 1,0-1,5 моль сульфата натрия, вымывают примеси первой фракции тем же буфером с сульфатом натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0-1,5 до 0,1 моль, а элюцию хитиназы осуществляют убывающим ат 1,0-1,5 до О мол. градиентом концентрации сульфата натрия в 0,01-0,02 М натрий-фосфатном буфере, при этом примеси второй фракции вымывают буферным раствором, содержащим сульфат натрия в убывающем градиенте концентрации от 1,0 — 1,5 до 0,3-0,4 моль, хитиназу с мол,м; 26 кДа вымывают раствором, содержащим сульфат натрия в концентрации 0,20,1 моль, а хитиназу с мол.м. 42 кДа вымывают 0,01-0,02 M иатрий-фосфатчым буфером, 1756354 таблица!! Ькэзэтепи для способа по примеру Условия разделения 5 6 7 8 9 2 3 4 рН буфера, уравновешива" ущего ИДК-агарозу 6,0 7,5 7 ° О, 7,0 7,0 7,0 7,5 5,0 рН элюирования балластных белков 6,0 7,0 7;5 5,0 7,0 7,0 7,0 7,0 оН элюций первой фракции белков, содержа4Ых хитиназу 6,0 5,0 5,0 4,4 4,8 5,0 4,9 4Ä0 3,0 4,7 4,0 3,8 3,9 4,0 4,0 7,0 7,2 7,0 7,0 6,8 6„9 6,9 7,0 Концентрация,м сульфата натрия в уравновешивающем буфере 1,0 1,5 1,3 1,0 1,0 1,0 1,0 0,2 0Ä2 0,2 то we в элюирующем растворе 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2 0,02 0,01 0,015 0,02 0,02 0,02 0,02 0,02 фосфатного буфера Таблица2 мкНС/cNAc Активность, (мин мг) 10> Способ по примеру Примечание Предлагаемый Х 1 "92, Х II-160, Х III-515 Х 1 - 09 ° Х II - 159> Х III«510 Х 1-90, X I-О0, Первая фракция не отделяется от балластных белков Первая и вторая фракции не разделяются Частичная инактивэция фермен-, тов Концентрация белка 1 мгlмл Известный 18-22 Составитель ИЛ1ривалова Техред М.Моргентал Корректор С.Патрушева Редактор H,Рогулич Заказ 3062 Тираж йодг1исное ВЙИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Рауаская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагаринa, 1О рН элюции второй фракции белков, содержащих хитиназу рН буфера, уравновешиваю" щего бутип-Тойоперл Х II - 160, Х Ш" 512 Х II 15Я, Х III - 513 Первая и вторая фракции белков не разделяются Плохое разделение первой и втором фракции белков
