Способ обнаружения веществ с цитокининовой активностью

 

Использование: биотехнология, регуляция роста растений, выявление веществ, обладающих цитокининовой активностью. Сущность изобретения: воздействуют испытуемым веществом на тест-объект, определяют цитокининзависимый параметр по сравнению с контролем. В качестве тестобъекта используют фракцию выделенных из растений злаков предварительно очищенных водорастворимых белков в количестве 0,02-0,5 мг/тест в смеси с высокомечеными цитокининами с радиоактивностью 10000-100000 расп/мин на тест. 1 табл., 1 ил.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4900344/13 (22) 08.01.91 (46) 07.04.93. Бюл. N 13 (71) Институт физиологии растений .им. К.А.Тимирязева (72) Г.А.Романов, В,Я.Тар, Э.М.Оруджев, 0.H.Êóëàåâà, Ф,А.Бровко и В.М,Липкин (73) Коммерческо-финансовая фирма "РЭН" (56) 1. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. — М,; Наука, 1973, с. 222 — 223.

2. Там же, с. 223-22 4.

3. Кудоярова Г.Р„Веселов С.Ю., Каравайко Н.Н, и др, Иммуноферментная тестсистема для определения цитокининов.—

Физиология растений, 1989, т, 37, с. 80 — 89.

Изобретение относится к биотехнологии и регуляции роста растений и может быть использовано для выявления веществ, обладающих цитокининовой активностью, необходимых для практики современного растениеводства и для научных исследований.

Целью изобретения является повыше. ние чувствительности и объективности, а также сокращение длительности и трудоемкости испытаний веществ на цитокининовую активность.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе, включающем воздействие испытуемого вещества на тест-объект в виде целых растений или их изолированных органов и последующую оценку результата по сравнению с контролем, в качестве тест-объекта используют определенное количество фракции растворимых белков иэ вегетативных органов злаков в смеси с ме„„5U„„1808128 АЗ (я)з G 01 N 33/534, А 01 N 65/00 (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВЕЩЕСТВ С

ЦИТОКИНИНОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Использование: биотехнология, регуляция роста растений, выявление веществ, обладающих цитокининовой активностью.

Сущность изобретения: воздействуют испытуемым веществом на тест-объект, определяют цитокининэависимый параметр по сравнению с контролем. В качестве тестобъекта используют фракцию выделенных из растений злаков предварительно очищенных водорастворимых белков в количестве 0,02-0,5 мг/тест в смеси с высокомечеными цитокининами с радиоактивностью 10000 — 100000 расп/мин на тест, 1 табл., 1 ил. ченым цитокинином, в соотношении 100—

1000 расп/мин радиоактивности гормона на 1 мкг белка. Для воздействия испытуемого вещества на тест-объектдостаточно 5 мин при 0 — 20 С и рН 6 — 9. Оценку эффекта ведут по содержанию меченого цитокинина, ассоциированного с белками, после их выделения иэ тест-системы по сравнению с контролем. Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый способ отличается от известного использованием в качестве тест-системы фракции растворимых белков злаков, обладающей способностью специфически взаимодействовать с цитокининами. В научно-технической и патентной литературе, посвященной поиску новых цитокининов, этот признак ранее не описан. Таким образом, заявляемый способ соответствует критерию

"новизна". Что касается антител, используемых для иммунологического определения

1808128 содержания эндогенных цитокининов, То они обладают узкой специфичностью и интенсивно взаимодействуют лишь с тем соединением (и его близким аналогом), против которого они были выработаны (3). Поэтому тест-система на основе антител не подходит для обнаружения новых веществ с цитокининовой активностью, Фракция природных белков из вегетативных частей злаков обладает необходимыми свойствами, позволяющими создать на ее основе тест-систему для поиска новых цитокининов. Во-первых, эти белки взаимодействуют с широким спектром различных цитокининов, включая цитокинины как аденинового ряда, так и производные дифенилмочевины, Во-вторых, указанные белки отличаются высокой стабильностью и не меняют своих свойств по ходу очистки и в процессе тестирования.

Полученная белковая. фракция может длительно храниться без изменения основных характеристик в соответствующих условиях, например, в замороженном растворе при (-29) — (-70) С, в виде осадка в растворе

75 — 80 от насыщения сульфата аммония при температуре от 0 С и ниже, а также в лиофильно высушенном виде.

Заявленный способ осуществляют следующим образом, Для получения тестобъекта смешивают в любой последовательности микрообъемы препарата белка в количестве 0,02 — 0,50 мг на тест с 0,2 — 5,0 пикомолями высокомеченого цитокинина с удельной радиоактивностью не ниже 100

ГБк/моль, для получения нужного количества радиоактивности в пробе, Затем к пробам добавляют испытуемое вещество и в качестве одного из наиболее удобных осадителей белка сульфат аммония до конечной концентрации 2,5 — 3,5 М, перемешивают, выдерживают 5-15 мин при рН 6-9 и

0-20 С, быстро отделяют образовавшийся осадок и определяют его радиоактивность.

Предлагаемые диапазоны условий тестированияя установлен ы экс пери ментал ьным путем и отражают основные свойства цитокининсвяэывающих компонентов используемой фракции растворимых белков злаков, Выход эа указанные границы рН и температуры приводит к быстрому исчезновению цитокининсвязывающей активности тест-объекта и тем самым к инактивации тест-системы в целом, Отход от рекомендуемых параметров количественных соотношений белка и меченого гормона приводит к существенному уменьшению диапазона количественного onределения цитокининовой активности и/или может вызвать значительный перерасход компонентов тест-системы.

Пример 1. В опыте используется фракция растворимых белков листьев ячменя, очищенная дробным высаливанием сульфатом аммония, в количестве 0,5 мг белка на тест. Температуру системы поддерживают вблизи 20 С, рН 7,5, В качестве радиоактивного лиганда используют меченый тритием зеатин с удельной радиоактивностью 95 ГБк/ммоль и в количестве 35000 расп/мин на тест, Испытуемым веществом служит природный цитокинин зеатин, растворенный в 20ф этаноле в воде. В конт"5 рольные пробы добавляют равный объем чистого, растворителя.. При добавлении в тест-систему зеатина в количестве 1,6 мкг и осаждении белков после 10 мин инкубации наблюдается более чем двукратное уменьшение радиоактивности белкового осадка по сравнению с контролем.

Результаты этого (пример 1) и других опытов представлены в виде сводной таблицы, где показано сравнение результатов определения для цитокининов (примеры 2 — 6) и иных соединений (примеры 7 — 10). На чер- . теже показана калибровочная кривая определения одного из представителей цитокининов дигидрозеатина, График де30 монстрирует возможность количественного определения цитокининовой активности в широком диапазоне концентраций этих биорегуляторов.

Вся процедура от момента подготовки

35 тест-объекта до получения готового результата может быть выполнена в течение 1 ч, Эта методика дает возможность проводить серийный анализ веществ -до сотни и более эа смену — в строго идентичных условиях.

40 Чувствительность способа была установлена в опытах с использованием очищенной фракции растворимых белков из листьев ячменя и меченого тритием дигидрозеатина с удельной радиоактивностью

45 около 900 ГБкlммоль в качестве меченого лиганда. Результаты показали, что минимальная концентрация немеченого дигидрозеатина, которая может быть количественно определена, составляет при50 мерно 0,3 пикомоля, что для данной тестсистемы соответствует всего 66 пикограмм этого фитогормона. Тем самым предложенный способ позволяет повысить чувствительность определения цитокининов по

55 сравнению с традиционными биотестами не менее чем на 3-4 порядка при существенной увеличении надежности определения.

Предлагаемый способ не представляет опасности для здоровья персонала и для окружающей среды, так как рассчитан на

1808128

Продолжение таблицы

Меченый лиган

Опыт

Немеченый лиган

Р/активность осадка, к контролю тип/название название кол-во распlмин количество мкг

Цитокинины: зеатин дигидроэеатин кинетин бензиламинопурин дифенилкарбамид диги озеатин

44

49

3еатин

Зеатин

Дигидрозеатин

Дигидроэеатин

60000

1,6

0,8

1,0

0,5

Дигидроэеатин игид озеатин

80000

0,2

0,003

77

65000 использование индикаторных микродоз одного из самых мягких изотопов — трития, находящегося на всех этапах тестирования в виде нелетучего соединения в разбавленном водном растворе. В связи с подбором условий хранения, при котором растворимые белки злаков не теряют своих полезных свойств, возможен централизованный выпуск препарата этих белков для обнаружения веществ с цитокининовой активностью.

Таким образом, замена физиологических тест-систем на биохимическую выгодно отличает предложенный способ от прототипа тем, что в связи с высокой чувствительностью позволяет анализировать микроколичества веществ; значительно Ilo вышает скорость определения до 100 и более раз; позволяет проводить испытание сразу большого количества веществ до сотни и более за смену в строго идентичных условиях; исключает метаболизацию исследуемого вещества и тем самым позволяет определить его собственную цитокининовую активность; повышает объективность испытаний в связи с однородностью тест-объекта; дает возможность проводить испытания круглогодично независимо от сезона года; позволяет провЬдить испытания непосредственно на химических предприятиях без привлечения специалистов-биологов; дает возможность более точно классифицировать соединения по их

5 цитокининовой активности в данной системе и унифицировать процедуру испытаний.

Формула изобретения

10 Способ обнаружения веществ с цитокининовой активностью, заключающийся в том, что на тест-объект воздействуют испытуемым веществом, а затем определяют цитокининзависимый параметр по сравнению

15 сконтролем, отличающийся тем,что, с целью повышения чувствительности и достоверности способа, в качестве тест-объекта используют фракцию очищенных водорастворимых белков, выделенных иэ

20 растений злаков, а количество 0,02 — 0,5 мг/тест, в смеси с мечеными цитокининами с радиоактивностью 10000 — 100000 расп/мин на тест, воздействие осуществляют не менее 5 мин при температуре 0-20 С

25 и рН 6 — 9, в качестве цитокининзависимого параметра определяют радиоактивность выделенных меченых цитокининов, ассоциированных с вышеуказанными белками, 1808128

Продолжение таблицы

*Степень очистки обозначена цифрами: 1 — фракционирование сульфатом аммония; 2 — то же, что 1 плюс гель-хроматография; 3 — то же, что 2 плюс ионообменная хроматография, **ИУК вЂ” индолилуксусная кислота

Редактор Л,Волкова

Корректор О.Кравцова

Заказ 1400 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Ф

О "2

Ф

Е

-2 -1,5 -1 -0.5 0 O,б

Heлечин,1 деГыд;Зозеа72Б, lag ныюль

Составитель Г.Романов

Техред М.Моргентал