Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg 1, 3, 4 человека

 

Использование: биотехнология иммуноглобулинов , разработка иммунодиагностикумов в биологии и медицине, аффинное выделение lgG2. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muscslus L продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к IgG 1,3,4 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы Sp/20 Ag14. МКА относятся к подклассу IgGI, они специфически взаимодейавуют с lgG1, G3, G4 человека, а также с их Рави Г-с-фрагментзми Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной - 5 мг/ма Продукция антител сохраняется в течение 29 пассажей в культуре и 14 пассажей на животных 1 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5043776/1 3 (22) 09.01.92 (46) 1511.93 Бюл. Ма 41-42

{71) Крымский медицинский институт (72) Ефетов КА; Тэтин С.Ю:, Князева ОА (73) Крымский медицинский институт (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS

L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К JGG 1, 3, 4 ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология иммуноглобу. линов, разработка иммунодиагностикумов в биологии и медицине, аффинное выделение lgG2. Сущ(19) RU (11) 2002803 С1 (51) 5 C12N5 00 С 12Р21 08 ность изобретения: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus muscslus L продуцирующего монокпональные антитела (MKA) к

lgG13,4 человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Salb/с с клетками weломы Sp/20 А@14. МКА относятся к подклассу lgG1, они спефифически взаимодействуют с 1д61, G3, 64 человека, а также с их Fae-. и F-с-фрагментами.

Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 5 — 10 мкг/мп, в асцитной — 5 мг/мл.

Продукция антител сохраняется в течение 29 пас-. сажей в культуре и 14 пассажей на животнык 1 табл.

2002803

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов 6 (igG) человека, аффинного выделения lgG2, разработки иммунодиагностикумов в биологии и медицине.

Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (MI(A) к Ig62, Ig61, 2, 3, 4 человека, Отличительное свойство предложенного штамма — зто продукция антител, с высокой аффинностью взаимодействующих с целыми молекулами IgG1, ig63, !964человека, их Fab- u Fc-фрагментами и не вступающих в реакцию с Ig62, 15

Преимущество полученных МКА заключается в возможности их использования доля аффинного выделения lg62 из сыворотки крови миеломных больных не только в мягких условиях, но и при физиологических зна- 20 чениях рН.

Кроме того, каждая вновь полученная гибридома уникальна, МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и многим другим.4>изико-химическим свойствам, Поэтому получение как можно большего количества моноклональных антител к иммуноглобулинам человека, 30 являющимся центральным звеном гуморального иммунитета, черезвычайно важно с научной и практической точки зрения.

Технический результат изобретения заключается в получении штамма гибридных 35 культивируемых клеток, продуцирующего

МКА к IgG1, 3, 4 человека, которые на взаимодействуют с IgG2 человека.

Штамм получают следующим образом, Мышей линии BAIB/c иммунизируют 40 внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG (выделенного из сыворотки крови больного аденокарциномой желудка методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией íà 45

ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 М фосфатном буферном растворе с 0,15 M NaCI, рН = 7,4 (P B S) в полным адью вантом Фрей нда. Иммунизацию повторяют через один месяц, но без адъюванта. Еще через один месяц 50 мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг igG в PBS. Через три дня у животных определяют титр антител к IgG человека (используемому для иммунизации) методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим и лмунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого 10 клеток селезенки иммунной мыши гибридизуют с 4 10 клеток миеломы Sp 2/0

Ag 4 в присутствии 50% полизтиленгликоля с мол.м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-ти луночные планшеты на 10 клеток на лунку. В качестве

5 питающего слоя используют перитонеальные макрофаги мыши, которые высевают по 10 клеток на лунку за сутки до гибриди4 зации, Гибридому клонируют два раза методом лимитирующего разведения (из расчета

32 клетки на 96-ти луночный планшет), высевая клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более

70% полученных субклонов продуцируют антитела к Ig61, 3, 4 человека. Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают А5В8.

Штамм А5В8 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма — суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии

ВА! В/с в дозе 1 млн. клеток на мышь, Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на

50-250 мл. Посевная доза 5.10 клеток на мл, Кратность рассева 1:5, время субкультивирования 3 — 4 дня. Среда для культивирования RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, В первые три недели после гибридизации в среду добавляют10 М гипоксантина, 4 10 Маминоптерина, и 1,6 10 M тимидина, так как клетки миеломы Sp 2/О Ag14 дефекты по ферменту гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазе. Клетки выращивают в атмосфере 5% COz при 37 С, Культивирование в организме животного. Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки (10) вводят в брюшную полость мышей HALB/ñ, которым предварительно (за 7 — 10 сут) внутрибрюшинной иньецируют пристан. Время образования асцита 10-14 дней, Характеристика полезного продукта, МКА, продуцируемые штаммом А5ВО, относятся к igG1 подклассу, специфически взаимодействуют с IgG1, ig63, Ig64 человека и их Fab- u Fc-фрагментами. Принадлежность к подклассу lgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против lgG мыши разных подклассов (Sigma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимодействие антител с lg61, 3, 4 человека определяют методом иммуноферментного анализа.

2002803

Продуктивность штамма, стабильность антител, Концентрация MKA через 3 — 4 дня культивирования "ин витро" составляет 5 — 10 мкгlмл, в асцитной жидкости 5 мгlмл. Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр

1/5000, Продукция антител сохраняется в течение 29 пассажей в культуре и 14 пассажей на животных. Контроль контаминации.

Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при окрашивании красителями на ДНК.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клети штамма заморгживают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10% диметилсульфоксида. Режима замораживания: сутки при -70 С, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на

20

37 С. Жизнеспособность клеток после размора>кивания составляет 80 — 90% по DKpaшиванию трипановым синим.

Пример 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25

25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37 С в 30 атмосфере, содержащей 5 / С02. Культуральную среду собирают. центрифугируют

10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий MKA к lgG человека применяют в иммуноферментном анализе. В качестве ан- 35 тигенов используют различные иммуноглобулина, выделенные из сыворотки крови больных миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией 40 на ДЭАЭ-целлюлозе: 1ц61 Бог, Ig61 Мис, lgG2 Рыб, IgG2 Боб,!962 Гол, 1962 б/н, Ig63

Дал, IgG4 Жел, IgG4 Бер, IgG4 б/н, IgA, а также igM, выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема пере- 45 осаждением бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией, и папаиновые Fab-, Fc-фрагменты IgG человека. Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 Na-карбонатном буфере, рН 50

9,2, и вносят по 50 мкл в лунку 96-ти луночного пластикового планшета. Инкубируют в течение 1 ч при 37 С, затем сливают и вносят по 100 MKJI к лунку 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч 55 при 37 С. После окончания инкубации раствор BSA сливают, планшет промывают холодной водой и PBS с 0,05 / теином (PBST), вносят супернатант культуральной среды по

50 мкл в лунку и инкубируют при 37 С, Керез 1 ч содержимое лунок сливают, промывают холодной водой и PBST, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител против igG мыши с пероксидазой в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубируют при 37 С 1 ч. После тщательной промывки в лунки вносят по 100 мкл 0,4 MM раствора субстрата — 2.2 -азино-ди-(3-этил бензтиазолинсульфонат(6)) (АВТО) в 0,05 M Ка-цитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем оценивают результат на спектрофотометре

"MuItiskan" (Fiow, Великобритания) при длине волны 405 нм.

Полученные данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (0,8 — 100%), представлены в таблице.

Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридом" А5В8 продуцирует МКА, сгецифически взаимодействующие с целыми молекулами!961, 3, 4 человека и их Fab- u Fc-фра.чиентами.

Пример 2, 30 мг МКА штамма А5ВЯ (полученных методом переосаждения сернокислым аммонием асцитной жидкости) смешивают с 1 г CNBr-сефарозы 4В (предпочтительно замоченной и промытой в 1 мМ

H CI) на шейкере в течение 2 ч при комнатной температуре. Получе iHblM аффинным сорбентом забивают стеклянную колонку объемом 5 мл и промывают в течение 3 ч со скоростью 3 кап/мин 0,1 М бикарбонатным буфером с 0,5 M NaCI, рН 8,3. Отмывают избыток белка рабочим буфером (бикарбонатным), блокируют избыток активных групп в геле раствором 0,2 М глицина (рН

8,0) 2 ч при комнатной температуре, отмывают сначала рабочим буфером, потом попеременно буферными растворами с высоким и низким значением рН на стеклянном фильтре 4 — 5 раз, затем промывают раствором PBS (рН 7,4) и пропускают 1 мл раствора IgS дон BPBS (с = 2 мг/мл) со скоростью

3 кап/мин. Элюат собирают порциями по 1 мл в 10 пробирок, определяют экстинкцию на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Для оценки результатов аффинной хроматографии проводят ИФА, который показывает, что выделен!962, Таким образом, предложенный гибридный штамм продуцирует МКА, которые специфически взаимодействуют с целыми молекулами IgG1, 3, 4 человека и их Fab- u

Fc-фрагментами. Полученные антитела могут эффективно использоваться для аффинного выделения IgG2, клинических и биохимических исследований.

2002803 (56) Jefferls R„Relmer С.В., Skwarll F. et al./

/Immunology Letters. — 1985. — ч. 10. -р. 223252.

Европейский патент Q 0163141, кл, С 12 P 21/00, 1985.

Составитель К, Ефетов

Редактор 8. Трубченко Техред М,Моргентал Корректор С. Лисина

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5

Заказ 3216

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Формула изобретен я . Я492 Д, используемый для получения моШтамм гибридных культивируемых кле-, ноклональных антител к JgG 1, 3, 4 человеток животных Миз muscutus ;, ВСКК (П) ка.