Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к @ -легким цепям иммуноглобулинов человека

Авторы патента:

C12N5 - Недифференцированные клетки человека, животных или растений, например клеточные линии; ткани; культивирование или сохранение их; питательные среды для них (размножение растений из тканевых культур A01H 4/00)

Использование: биотехнология иммунология, медицина. Сущность изобретения: гибридный штамм, продуцирующий моноклональные антитепа к X -легким цепям иммуноглобулинов чеповекэ, получен при гибридазации клеток спезенки мышей BALB/C, иммунизированных препаратом IgG человека , с клетками миеломной линии Sp2/OAg14 Штамм обозначен Е5 и хранится под номером ВСКК(П) М564Д Продуктивность штамма составляет 5-10 мкг/мп антител в культуральной жидкости и 5 мг/мп в асцитической. Моноклональные антитела специфически связываются с Л -легкими цепями иммуноглобулинов человека.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5028456!13 (22) 24.0292 (46) 30.11.93 Ьой йв 43-44 (71) Крымский медицинский институт (72) Ефетов КА; Князева ОА; Тэтин С.Ю„Троицкий

IE (73) Крымский медицинский институт (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L вЂ” ЙРЩЦУЦфНТ МОНОКЙОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К Л-ЛИХИМ ЦЕЛЯМ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ

ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология. иммунология, (1Е) RU (11) 2003682 С1 (51) 5 C 12 N S ОО медицина. Сущность изобретения: гибридный штамь продуцирующий монокпональные антитела к

Х -легким цепям иммрюглобулинов человека, получен при гибридазации клеток спезенки мь.шей

ВИ.В/с, иммунизированных препаратом IgG человека, с клетками миеломной линии Sp2/0Ag14.

Штамм обозначен Е5 и хранится под номером

ВСКК(П) М564Д. Продуктивность штамма состазляет 5 вЂ” 10 мкг/мп антител в культуральной ткидкости и 5 мг/мл в асцитической. Моноклональные антитела специфически связываются с Л -легкими цепями иммуноглобулинов человека.

2003682

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулина человека, клинической диагностики ряда патологических состояний, связанных с моноклональной протеинемией и протеинурией. Получение больших количеств таких антител возможно только с помощью гибридомной технологии. В литературе имеются сообщения о получении мышиных моноклональных антител к А-цепям иммуноглобулинов человека.

Но каждая вновь слитая гибридома является новой по определению, так как синтезируемые ею моноклональные антитела индивидуальны по первичной структуре, специфичности по отношению к данной детерминанте, аффин ности, цитотоксичности, гемагглютинирующим и другим cBDAcTBaM.

Получение набора антител к разным антигенным детерминантам иммуноглобулинов рэсширяет возможности иммунологических методов исследований.

Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцируемого моноклональные антитела к А -легким цепям иммуноглобулинов человека, пригодные для использования в различных видах биохимических и иммунологических исследований.

Происхождение штамма, Для иммунизации использовали мышей

BALB/ñ. Антиген вЂ” IgG (выделенный из сыворотки крови больного аденокарциномой желудка методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-трисакриле М) вводили внутрибрюшинно в количестве 100 мкг в зэбуференном Физрастворе с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию проводили через месяц таким же количеством антигенэ, но без адьювэнта. Через 4 недели после второй иммунизации мышам вводили 100 мкг препарата внутривенно. Через З,дня у животных определялся титр антител к антигену, используемому для иммунизации, методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом использовали для получения гибридомы. Для этого 10 клеток селезенки иммунной мыши гибридиэовэли с 4 10 клеток миеломы Sp 2/О т

Ag14 в присутствии 50 -ного раствора по лиэтиленгликоля с мол, мэс. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевали в 96-луначные планшеты по 10 клеток на лунку. 8 качестве питающего слоя использовали перитоиеальные мэкрофаги мыши, которые высевали по 10 клеток на лунку эа

4 сутки до гибридизации. Для культивирования и селекции гибридомы использовали среду RPMJ-1540 с добавлением 20 фетальной бычьей сыворотки, 10 M гипоксантина, 4 10 М аминоптеринэ и 1,6 10 5

М тимидина. Гибридому клонировали 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 1 клетка на 3 лунки 96-луночного планшета). После второго клонирования более 90 полученных субклонов продуцировали антитела к легким - цепям

10 иммуноглобулинов человека. Продукция ан- тител сохранялась в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных. Среда для культивирования вЂ” среда RPMJ-1640 с добавлением 10 фетальной бычьей сыво"5 ротки, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по

100 ед!мл пенициллина и стрептомицина.

Посевная доза 10 клеток в 1 мл. Через 2-3 дня концентрация антитела в культуральной жидкости достигала примерно 40 мкг/мл.

Контаминации бактериями, грибками и микроплазмами на обнаружено.

Для длительного хранения гибридомные клетки могут быть заморо>кены в фетальной бычьей сыворотке с добавлением

10 диметилсульфоксидэ. Способ криоконсервирования -сутки при -70 С, затем клетки переносятся в жидкий азот.

Размораживают клетки, перенося ампулу жидкого азота в водяную баню на 37 С.

30 Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводили в брюшную полость мышей ÂALB/с (предварительно обработанных внутрибрюшинно тетраметилпентадеканом) в количестве 10 клеток на мышь. Опухоли развивались у мышей через 10-14 дней. Секреция антител клетками гибридомы, выращиваемой в асцитной форме, сохранялась в течение 25 пассажей на животных, 40 Гибридома получила условное название

Е5. Моноклональные антитела. продуцируемые штаммом Е5, относятся к первому подклассу мышиных IgG и взаимодействуют с легкими А - цепями иммуноглобулинов че45 ловека. Принадлежность к подклассу определяли при помощи преципитирующих антисывороток к мышиным IQG разных подклассов (Sigma, США) методом двойной радиальной иммунодиффузии flo Оухтерлони.

Взаимодействия антител с легкими Х -цепями иммуноглобулинов человека определяли методом иммуноферментного анализа.

Пример. Гибридомные клетки помещали в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMJ 1640 с добавлением 10 фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по

100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, Клетки культивировали 3-4 дня при 37ОC в

2003682

Формула изобретения

Составитель К.Ефетов

Техред M.Ìîðãåíòàë

Редактор Л.Павлова

Корректор О.ГустивЂ” г

Заказ 3308

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 атмосфере, содержащей 5% С02. Культуральную среду собирали, центрифугировали 10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий моноклональные антитела к легким - цепям иммуноглобулинов человека, использовали в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов вносили белки

Бенс-Джонса (выделенные из мочи больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) и различные моноклональные иммуноглобулины с известным типом легких цепей (выделенные из крови больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) в концентрации 10 мкг/мл бикарбонатном буферном растворе по 50 мкл в лунку на 96-луночном пластиковом планшете. Инкубировали в течение 60 мин при 37 С, затем сливали и вносили по 100мкл в лунку 1 раствор бычьего сывороточного альбумина на 60 мин при

37 С. После окончания инкубации раствор альбумина сливали, планшет промывали холодной водой и забуференным физраствором м 0,05 таином (PBST), вносили супернатант культуральной среды по 50 мл в лунку и инкубировали при 37 С. Через 60 мин все сливали, промывали холодной водой и P8ST, добавляли по 50 мкл конъюгата

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П) антител к IgG мыши с пероксидаэой в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубировали при 37 С 60 мин. После тщательной промывки в лунки вносили субстрат вЂ” 2,2 5 азино-ди-(3-этилбенэитиаэолинсульфонат

/6/1 (ABTS) в 0,05 М цитратном буфере с добавлением перекиси водорода и инкубировали на шейкере при комнатной температуре (21 С) в течение 30 мин, после чего

10 оценивали результат на спектрофотометре

"Мц! Паап" (Fiow, Великобритания) при длине волны 405 нм, Получены следующие данные, выраженные в процентах от максимальной эхс15 тинкции (1,0 вЂ” 100 ): легкие k цепи иммуноглобулинов человека 100: легкие Ацепи иммуноглобулинов человека О, Таким образом, было показана. что гибридома Е5 продуцирует моноклональные

20 антитела, взаимодействующие с легкими Ацепями иммуноглобулинов человека. Получен новый по определению, патентоспособный штамм клеток.

25 (56) Оивень Н.В„Вигдорович И.П. 1-й Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи, ноябрь, 1989).Тез. докл. 1989, т.1, с, 167, й564Д - продуцент моноклональных антител к А - легким цепям иммуноглобулинов человека,

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к @ -легким цепям иммуноглобулинов человека

Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к igm человека // 2003680

Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg 1, 2, 3 человека // 2003679

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg 1, 3, 4 человека // 2002803

Штамм инфузории colpoda steinii для приготовления токсикологического диагностикума // 2001951

Способ культивирования опорно-зависимых клеточных культур // 1839460

Изобретение относится к области биотехнологии, точнее к технике культивирования тканевых клеток животных и человека, и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве, вирусологии, онкологии, для получения клеточной биомассы, в производстве биологически активных веществ (интерферона, гормонов, антител, ферментов и т.д.) вакцин и сывороток

Способ получения гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к фикомицетам рода рнyторнтоrа, штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulus l., используемый для получения моноклональных антител к фикомицетам рода рнyторнтоrа, способ получения моноклональных антител к фикомицетам рода рнyторнтоrа // 1836421

Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l - продуцент моноклональных антител к холерному энтеротоксину // 1835848

Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в диагностических тест-системах иммуноанализов на холерный энтеротоксин, его отдельную В-субъединицу, в частности при дифференциации токсинпродуцирующих штаммов холерного вибриона

Бессывороточная питательная среда для культуры ткани // 1830080

Способ приготовления подложки для культивирования клеток заднего эпителия роговицы глаза // 1822876

Способ выращивания биомассы женьшеня // 2101934

Штамм перевиваемых клеток человека сем-к, устойчивый к вич- инфекции // 2102477

Способ выращивания растений in vitro // 2102870

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, в частности к способам микроклонального размножения растений и безвирусному семеноводству

Питательная среда для культивирования клеток эукариотов и способ получения основы питательной среды - протеолитического гидролизата // 2103360

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной биотехнологии и касается усовершенствованного способа получения протеолитического гидролизата отходов переработки рыбы, а также питательной среды на его основе, предназначенной для выращивания клеток эукариотов - продуцентов биологически активных веществ, используемых для производства диагностических и профилактических биологических и медицинских препаратов

Конъюгат на основе анти-jgm-антитела (варианты) и способ снижения секреции jgm антитела лимфоцитами (варианты) // 2105062

Изобретение относится к области иммунологии, в частности к получению и использованию моноклональных антител

Способ получения сухих стерильных питательных сред для культур клеток // 2107724

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения сухих стерильных питательных сред для культивирования разнообразных культур клеток, широко используемых в различных областях биологии, медицины, клеточной биотехнологии

Способ селекции популяции клеток in vivo // 2111249

Изобретение относится к области биотехнологии, а точнее к способам изменения степени стабильности кариотипа клеток

Способ селекции популяции клеток in vivo // 2111249

Способ получения ростовых протеинов из сывороток крови различных видов животных // 2112799

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при работе с клеточными культурами и в вирусологии