Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к igm человека

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕН 1 У .

Кемитет Российской Федерации не патентам и товарным знакам

1 (21) 5021671/13 (22) 10.01.92 (46) 30.11.93 Бюл. Йя 43-44

Р1) Крымовой медицинский институт

p2) кетов КА; Тэтин С.Ю„Князева ОА„Троицкий .Г.В. (УЗ} Крымский медицинский институт (64) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК NUS 1IIIUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕЦИПИТИРЯОЩИХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

IGIIN ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, структурные и функциональные исследования IgM человека. раз(о) )Щ (1ц 2003 (51) 5 С 12N5 00 С И Р21 08 работка диагностических препаратов. Сущность изобретения: получение штамма гибридных культи— вируемых клеток Mus musculus . продуцирующего моноклональные антитела (MKA) к IgM человека, которые обладают преципитирующими свойствами.

Штамм получают гибридизацией спленоцитов иммуных мышей линии Balb/с с клетками миеломы Sp

2/О Ag 14, Моноклональные антитела относятся к

IgG2b. Они специфически взаимодействуют с IgM человека и его (Fc)5 (Fc)5p — фрагментами и обладают преципитирукхцими свойствами. Концентрация MKA в культуральной жидкости составляет 5—

10 мкг/мл, а асцитной — 5 мг/мп 1 табл

2003680

Штамм В2 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма — суспенэионный, клетки округлой формы, в основном одиночные, Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований

IgM человека, разработки иммунодиагностических и иммунотерапевтических препаратов.

Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к lgM человека (1,2J.

Однако данные антитела не обладают 10 преципитирующими свойствами, Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток

Mus muscuIus L., продуцирующего преципитирующие MKA к!gM человека. 15

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BAL В/с иммунизируют введением 100 мкг препарата (Fc)5 р -фрагмента IgM человека (полученного при гельфильтрации трипсинового гидролизата igM, 20 выделенного из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема) в 0,005 M фосфатном буферном растворе с 0,15 M NaCI, рН

7,4 (PBS) с полным адьювантом Фрейнда.

Иммунизацию повторяют через месяц, но 25 антиген вводят беэ адьюванта. Через 4 недели после второй иммунизации мышам вводят 100 мкг препарата внутривенно. Через 3 дня у животных определяют титр антител к Ig M человека методом 30

° иммуноферментного анализа. Животное с наилучшим иммунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого 10 клеток селезенки иммунной мыши гибридиэуют с 4 10 клеток миеломы Sp 2/О Ag 14 в присутствии 50 -ного раствора полиэтиленгликоля с мол, мас. 4000. После гибридизации клетки высевают в 96-ти луночные планшеты по 10 клеток на лунку. В качестве питающего слоя используют перитонеаль- 40 ные макрофаги мыши, которые высевают по

10 клеток на лунку за сутки до гибридиэа4 ции. Гибридому клонируют 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96-ти луночный планшет), высевая 45 клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90 полученных субклонов продуцируют антитела к !9М человека, Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и 50 обозначают В2. перитонеальную полость мышей линии BAL

В/с в дозе 1 млн, клеток на мышь.

Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на

50-250 мл. Посевная доза 5 10 клетЬк на

1 мл. Кратность рассева 1:5, время субкультивирования 3-4 дня. Среда для культивирования RP Ml-1640 с добавлением 10 фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, В первые 3 недели после гибридизации в соеду добавляют 10

М гипоксантина, 4 10 М аминоптерина и

1,6 . 10 М тимидина, так как клетки мие-. ломы Sp 2/О Ag 14 дефектны по ферменту гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе, Клетки выращивают в атмосфере 5

С02 при 37 С.

Культивирование в организме животного. Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки (10 ) вводят в брюшную полость мышей ВА В/с, которым предварительно (за 7-10 сут.) внутрибрюшинно иньецируют пристан. Время образования асцита 10-14 дней.

Характеристика полезного продукта.

МКА, продуцируемые штаммом В2, относятся к IgG2b, специфически связывают IgM u (Fc)5 -фрагменты IgM человека и преципитируют эти же антигены. Принадлежность к определенному подклассу lgG определяют с помощью преципитирующих сывороток к

lgG мыши разных подклассов методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Способность к преципитации с IgM и (Fc)5 ,и-фрагментами IgM человека также выявляют методом Оухтерлони. Взаимодействие антител с (Fc)5 и IgM человека определяют методом иммуноферментного анализа.

Продуктивность штамма, стабильность продукции антител; Концентрация МКА через 3-4 дня культивирования 1и vitro составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости 5 мг/мл, Контроль продуктивности осуществляют с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных.

Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды, Заражение микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на

ДНК.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма эамораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10;(, диметилсульфоксида. Режим замораживания; сутки при -70 С, затем

2003680 ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу иэ жидкого азота в водяную баню на

37 C. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 70-80 по окрашиванию трипановым синим.

П.р и м е р 1. Гибридомные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMI5

1640 с добавлением 10 фетальной сыворотки, по 2 MM глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 СО . Культуральную среду собирают, центрифугируют 10 мин при 80 об./мин, Супернатант, содержащий

МКА к IgM человека применяют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов используют различные иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови здоровых людей и больных миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммо нием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе: ig

Дон., lgA, IgGI Куз, IgGI Бог, IgG2 Рыб, IgG2

Боб, IgG3Дал, IgG4Жел, tgG4 Бер, IgG46/í а также Ig M, выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема переосаждением бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией и (Fc)5 рфрагменты IgM человека (полученные гельфильтрацией трипсинового гидролизата

IgM), Антигены разводят в концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфере, рН

9,2 и вносят llo 50 мкл в лунку 96-луночных пластиковых планшетов. Инкубируют в течение 1 ч при 37 С, затем сливают и вносят по 100 мкл в лунку 1 раствор бычьего сывороточного альбумина на 1 ч при 37 С.

После окончания инкубации раствор альбумина сливают, планшет промывают холодной водой и PBS с 0,05 таином (PBST), вносятсупернатант культуральной среды по

50 мкл в лунку и инкубируют при 37 С. Через 1 ч содержимое лунок сливают, лунки промывают холодной водой и PBST, добавляют по 50 мкл конъюгата кроличьих антител к IgG мыши с пероксидазой в разведении 1:500 в растворе PBST и инку5

45 бируют при 37 С 1 ч. После тщательного промывания s лунки вносят 0,4 мМ раствора субстрата — 2,2 -азино-ди-(3-зтиленбенэтиазолинсульфоната /6/) (ABTS) в 0.05 М Naцитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01%- и инкубируют на шейкере при. комнатной температуре (20 С) в течение 30 мин, Затем оценивают результаты на спектрофотометре при длине волны 405 нм.

Полученные данные представлены в таблице, Данные, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома В2 продуцирует МКА, специфически взаимодействующие с IQM человека и их Fc-фрагментами, Пример 2, На стеклянную пластину наливают 3 -ный раствор агара в PHS. Пробойником формируют лунки на расстоянии

0,6 см друг от друга. B центральную лунку вносят асцитную жидкость гибридомного штамма В2. В боковые лунки вносят IQM, (Fc)5p, IgG, IQA, бычий сывороточный альбумин {В$А). Через 24 ч при взаимодействии

IgM и {Гс)5,и с МКА штамма В2 формируются полосы преципитации, которые не образуются в случае взаимодействия антител с

iQG, IgA u BSA.

Таким образом, предложенный гибридный штамм продуцирует преципитирующие

М КА, которые специфически в за и юдействуют с igM человека и их Fc-фрагментами.

Полученные антитела могут эффективно использоваться для структурных и функциональных исследований IQM:åëîâàêà, разработки диагностических тест-систсм и иммунотерапевтических препаратов в биологии и медицине. (56) 1, Левицкий В,А., Тоотс И,Э., Цибиногина Т.Н. Получение новых линий гибридных клеток, секретирующих моноклональные антитела к человеческим иммуноглабулинам класса M. Изв. АН Лата, ССР, 1989., hh

12, с. 104-107.

2. Авторское свидетельство СССР

N 1493668, С 12 N 5/00, 1989, 2003680 формула изобретения - . пользуемый для получения

Штамм гибридных культивируемых кле- пРе4ипи™РУюЩих моноклональных антиток Mus musculus L. 8СКК (П) 410 0 исПроизводственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Составитель М,Серова

Техред М.Моргентал . Корректор 0, Густи

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5