Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к jgg 1, 2, 3 человека

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ .

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5021 475/13 (32) 09.01.92 (46).30.11.93 Бюл. Йа 43-44

P1) Крымский медицинский институт (72) Ефетов КА; Тэтин С.Ю.; Князева 0А; Троицкий

Г.В. (73) Крымский медицинский институт (54} ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК INUS МВ$СЦШ$ L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ. ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К JGG 1, 2, 3 ЧЕЛОВЕКА (И) Использование: биотехнология, структурные и функциональные исследования иммуноглобулинов человека, а также разработка иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине. Сущность (В) RU (1Ц 2003679 С1 (51) 5 С ИМ5 ® С 12Р21 08 изобретения: получение штамма гиоридных культивируемых клеток животных Mus muscuius t продуцирующего-монокпональные антитела (MKA) к

igG1, G2. G3 человека, не взаимодействующие с их

Fab- M Fc — фрагментами. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/с с клетками миепомы Sp 2/0 Ад14. Монокпональные антитела относятся к подклассу igG1, они взаимодействуют с целыми молекулами Ig61, ig62 и IgG3 человека и не связываются с их Fab- и Ес-фрагментами. Концентрация MKA в культуральной жидкости составляет 5 — 10 мкг/мл, в асцитной — 5 мг/мл.

Продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных 1 табл.

2003679

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов G (IgG) человека, аффинного выделения lgG4, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине.

Известны штаммы, продуцирующие моноклональные антитела (МКА) к IgG4 (Ц, а также к lgG1, 2, 3, 4 человека (2j, Отличительным свойством предложенного штамма является продукция МКА, взаимодействующих с целыми молекулами

IgG1, IgG2, IgG3 человека и не вступающих в реакцию с IgG4 и с Fab-, Fc- фрагментами

lgG.

Преимущество МКА к lgG1, 2, 3 перед

МКА к lgG4 заключается в возможности их использования для выделения 1964 из сыворотки крови человека методом аффинной хроматографии, так как позволяет проводить элюцию при физиологическом значении рН, не денатурируя выделяемый белок.

Кроме того, необходимо отметить, что каждая вновь полученная гибридома уникальна. МКА, продуцируемые разными гибридомами, различаются по своей первичной структуре, специфичности к различным антигенным детерминантам, аффинности и многим другим физико-химическим свойствам.

Технический результат изобретения заключается в получении штамма гибридных культивируемых клеток Mus musculus I., продуцирующего МКА к целым молекулам

IgG1, 2, 3 человека.

Штамм получают следующим образом.

Мышей пинии BAIB/ñ иммуниэируют внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG (выделенного из сыворотки крови больного хроническим лимфолейкоэом методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе) в 0,005 M фосфатном буферном растворе с 0,15 M NaCI, рН 7,4 (PBS) с полным адъювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через 4 недели, но антиген вводят без адъюванта. Через 4 недели мышей бустируют путем внутривенного введения 100 мкг lgG в PBS, Через 3 дня у животных определяют титр антител к lgG человека (используемому для иммунизации) методом иммуноферментного анализа.

Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого

10 клеток селезенки иммунной мыши гибридиэуют с 4 10 клеток миеломы $р 2/О

Ag14 в присутствии 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с мол. мас. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевают в 96-луночные планшеты по 10 клеток на лунку. В качестве питающего слоя используют перитонеальные макрофаги мыши, которые высевают по 10 клеток на лунку за сутки до гибридизации. Гибридому клонируют 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96-луночный планшет), высевая клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клониро10 вания более 70 полученных субклонов продуцируют антитела к 1961, 2, 3 человека.

Наиболее продуктивный клон выводят в массовую культуру и обозначают Л2Н2.

Штамм Л2Н2 характеризуется следую"5 щими признаками.

Морфологические признаки. Тип роста штамма — суспензионный, клетки округлой формы, расположены кластерами. Гибридо.ма вызывает образование смешанных ас20 цитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость мышей линии

ВАI В/с в дозе 1 млн. клеток на мышь.

Культуральные признаки. Гибридому культивируют в пластиковых флаконах на

25 50-250 мл. Посевная доза 5 10 клеток на:

1 мл. Кратность рассева 1:5, время субкультивирования 3-4 дня. Среда для культивирования — КРМИ640 с добавлением 10 фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ глутами30 на, 2 мМ пирувата, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина, В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют-10

М гипоксантина, 4 10 аминоптерина и

1,6 10 5 Mтимитидина,,так как клетки ми35 еломы Sp 2/О Ag14 дефектны по ферменту гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе. Клетки выращивают в атмосфере 5

С02 при 37 С.

Культивирование в организме животно40 lo. Для выращивания гибридомы s асцитной форме клетки (10 ) вводят в брюшную полость мышей 8AL В/с, которым предварительно (эа 7-10 сут) внутрибрюшинно . инъецируют пристан. Время образования

45 асцита 10-14 дней.

Характеристика полезного продукта.

МКА, продуцируемые штаммом Л2Н2. относятся к IgG1 подклассу, специфически свяэыва1от IgG1. IgG2. IgG3 человека.

50 Принадлежность к подклассу lgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против IgG мыши разных подклассов (SIgma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимодействие

55 антител с lgG1, 2, 3 человека определяют методом иммуноферментного анализа.

Продуктивность штамма, стабильность продукции антител. Концентрация МКА через 3-4 дня культивирования in vitro состав2003679

Экстинкция. ляет 5-10 мкгlмл, в асцитной жидкости — 5 мг/мл. Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продукция антител сохраняется в течение 30 пассажей в культуре и 25 пассажей на животных, Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на

ДНК.

Способ криоконсервирования. Для длительного хранения клетки штамма замораживэют в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10 диметисульфоксида. Режим замораживания: сутки при -70 С, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на

37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания составляет 80-90 по окрашиванию трипановым синим, Пример . Гибридомыне клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 10 фетальной сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед./мл пенициллина и стрептомицина.

Клетки культивируют 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 57 СО2. Культуральную среду собирают, центрифугиртуют

10 мин при 800 об/мин. Супернатант, содержащий MKA к lgG человека, применяют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов используют различные иммуноглобулины, выделенные из сыворотки крови больных миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе: IgG1 Бог, lg61 Мис, IgG1 Гол, UgG2 Рыб, IgG2 Боб. IgG2 б/и, IgG3 Дал, IgG4 Жел, IgG4 Бер, lg64 б/н, IgA, а также IgM, выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстпема переосаждением бидистиллированной

45 водой с последующей гель-фильтрацией, и папаиновые Fab, Гс-фрагменты lgG человека. Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05 М Na-карбонатном буфера, рН

9,2 и вносят по 50 мкл в лунку 96-луночного пластикового планшета. Инкубируют в течение 1 ч при 37 С, затем сливают и вносят по

100 мкл в лунку 1 -ный раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при

37 С. После окончания инкубации раствор

BSA сливают, планшет промывают холодной водой и PBS c 0,05% твином (PBST), вносят супернатант культуральной среды по

50 мкл в лунку и инкубируют при 37 С. Через

1 ч содержимое лунок сливают, промывают холодной водой и PBST, добавляют по 50 мкл коньюгата кроличьих антител против

1gG мыши с пероксидазой в раэведснии

1;500 в растворе PBST и инкубируют при

37ОС 1 ч. После тщательной промывки в лунки вносят по 100 мкл 0,4 мМ раствора субстрата—

2,2 -азино-ди-(3-зтил ен бензтыазол инсул ьфонат/6/) (ABTS) в 0,05 М Na-цитратном буфере, рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин, Затем оценивают результат на спектрофотометре

" JIUlllst;an" (Flow, Великобритания) при длине волны 405 нм.

Полученные данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (1,4-100%), представлены в таблице.

Данные. представленные в таблице, свидетельствуют о том, что гибридома Л2h2 продуцирует МКА, специфически взаимодействующие с целыми молекулами 1961, 1962,1963, не вступа ощие в реакцию с Fab-, Fc-фрагментами lgG человека. (56) 1.Harada $.,Nishimura S., Saiga А. ет

at.// Mi1:robioI. and ImmunoI.- 1989.- 33, ¹

7.-р, 579-592.

2. Европейский патент К. 0163141, кл. С

12 P 21/00, 1985.

2003679

Продолжение таблицы

Ф р р мул а и зоб рете н и я 474 О, используемый для получения моно ММ бридных культивируемых кле- клойальных антител к lgG 1, 2, 3 человека, ток животных Mus Мовсиъа L ВСКК(П) й

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Составитель К.Ефетов

Техред М.Моргентал Корректор П.Герещи

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб,. 4I5