Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к (fc) @ - фрагменту igm человека

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5028461/13 (22) 24.02.92 (46) 30.1193 Бюл. Йя 43 — 44 (71) Крымский медицинский институт (72) Ефетов КА; Тэтин С.Ю„. Князева ОА. (73) Крымский медицинский институт (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS MUSCULUS L — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕП

К (Fc)5p — ФРАГМЕНТУ IGM ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, иммунология, медицина. Сущность изобретения: гибридный (ю) КЦ (и) 20036S4 Cl (51) 5 С 12N5 00 штамм, продуцирующий монокпональные антитела к (Fc)5p — фрагменту-IgM человека, получают при гибридизации клеток селезенки мышей BALB/с, иммунизированных препаратом (Гс) 5 тт — фрагмента IgM человека, с клетками миеломной линии

Sp2/OÀg14. Секретируемые гибридомой моноклонапьные антитела связываются с (Fc)5 тт — фрагментом IgM человека, но не с целой молекулой IgM.

Штамм обозначен ВЗ и депонирован под номером

ВСКК(П) 471Д. Биосинтез антител в культуральной жидкости составляет 5 — 10 мкг/мл, в асцитической — 5 мг/мл.

2003684

11эобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобу IMHQB M человека, контроля качества препаратов lgM, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине. Получение больших количеств таких антител возможно только с помощью гибридомной технологии. В литературе имеются сообщения о получении мышиных моноклональных антител к IgM, Но любая вновь получения гибридома является новой по определению, так как синтезируемые ею моноклональные антитела индивидуальны по первичной структуре, специфичности по отношению к данной антигенной детерминанте, аффинности и другим caoAGTBBM.

Получение набора антител к разным антигенным детерминантам иммуноглобулина

M позволяет использовать целый спектр вариантов иммунологических методов.

Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцирующего моноклональные антитела к (Fc)5 р -фрагменту Ig M человека, пригодные для использования о различных видах биохимических и иммунологических исследований, Происхождение штамма. Мышей линии

ВAlB/с иммунизировали внутрибрюшинным введением 100 мкг препарата (Fc}5p фрагмента IgM человека (полученного гель-фильтрацией трипсинового гидролизата IgM, выделенного из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема) в забуференном физрастворе с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяли через месяц, но антиген вводили без адьюванта. Через 4 недели после второй иммунизации мышам вводили 100 мкг препарата внутривенно, Через 3 дня у животных определяли титр антител к(Ес)5 и-фрагменту!9М методом иммуноферментного анализа.

Мышь с лучшим имунным ответом использовали для получения гибридомы. Для этого

10 клеток селезенки иммунной мыши гиб8 ридизовали с 4 " 10 клеток миеломы Sp 2/О

Ag14 в присутствии 50 -ного раствора полиэтиленгликоля с мол. мас. 4000 (Marek, ФРГ), После гибридизации клетки высевали в 96-луночные панели по 10" клеток на лунку. В качестве питающего слоя использовали перитонеальные макрофаги мыши, которые высевали по 10 клеток на лунку за а сутки до гибридизации, Для культивирования и селекции гибридомы использовали среду ВРМИ640 с добавлением 20 фетальной бычьей сыворотки, 10 М гипо-а ксантина, 4 . 10 7 M аминоптерина и

1,6 10 М тимитидина. Гибридому клонировали 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 1 клетка на 3 лунки

96-луночного планшета). После второго клонирования более 80 полученных субклонов продуцировали антитела к (Fc)5 ,и-фрагменту igM человека. Продукция антител сохранялась в течение 25 пассажей в культуре и 20 пассажей на животных. Среда для культивирования — среда RPMI-1640 с

10 добавлением 10/ фетальной бычьей сыворотки. 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, 100 ед./ мл пенициллина и 100 мкг/ мл стрептомицина. Посевная доэа 10 клеток в 1 мл.

Через 2-3 дня концентрация антитела в

"5 культуральной жидкости достигала примерно 40 мкг/мл.

Контаминации бактериями, грибками и микоплазмами не обнаружено.

Для длительного хранения гибридом20 ные клетки могут быть заморожены в фетальной бычьей сыворотке с добавлением

10 диметилсульфоксида. Способ криоконсервирования — I сут при -70 С, затем клетки переносятся в жидкий азот.

Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на 37 С.

Для выращивания гибридомы в асцитной форме клетки вводили в брюшную полость мышей BALB/с. предварительно

30 обработанных пристаном, в количестве 10 клеток на мышь, Опухоли развивались у мышей через 10414 дней. Секреция антител клетками гибридомы, выращиваемой в асцитной форме, сохранялась в течение 20 пассажей на мышах.

Гибридома получила условное название

ВЗ. Моноклональные антитела. продуцируемые штаммом ВЗ, относятся к первому подклассу мышиных IgG и связывают

40 (Fc)5 р -фрагменты igM человека. Принадлежность к подклассу определяли при помощи прецепитирующих антисывороток против igG мыши различных подклассов (S!gma, США) методом двойной радиальной

45 иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимодействие антител с (Fc)5 и-фрагментами

IgM человека определяли методом иммуноферментного анализа.

Пример . Гибридомные клетки поме50 щали в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды RPMI1640 с 10% фетальной сывороткой, 2 мМ глутамина. 2 мМ пирувата, по 100 ед./ мл пенициллина и стрептомицина. Клетки куль55 тивировали 3-4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 СОр. Культуральную среду собирали, центрифугировали 10 мин при

800 об /мин, Супернатант, содержащий моноклональные антитела к (Fc)5 р -фрагмен2003684

Формула изобретения,й471Д - продуцент моноклональных антиШтамм гибридных культивируемых кле- TeR K (Fc)5p-фрагменту 19М человека. ток животных Mus musculus L. ВСКК(П) 30

Составитель К.Ефетов

Техред М.Моргентал Корректор П.Гереши

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Тираж . Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ноклональные антитела к (Fc)5 р -фрагментам lgM человека, использовали в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов вносили различные моноклональные иммуноглобулины (выделенные из сыворотки крови больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) и (Fc)5 р -фрагменты IgM человека (полученные гель-фильтрацией трипсинового гидролиза та IgM) в концентрации l0 мкг/мл в бикарбонатном буферном растворе по 50 мкл в луку в 96-луночном пластиковом планшете.

Инкубировали в течение 60 мин при 37ОС, затем сливали и вносили по 100 мкл в лунку

1 раствор бычьего сывороточного альбумина на 60 мин при 37ОС. После окончания инкубации раствор альбумина сливали, планшет промывали холодной водой и забуференным физраствором с 0,05 твином (PBST), вносили супернатант культуральной среды по 50 мкл в лунку и инкубировали при

37 С. Через 60 мин все сливали, промывали холодной водой и PBST, добавляли по 50 мкл коньюгата антител к IgG мыши с пероксидазой (Sigma, США) в разведении 1;500 в растворе PBST и инкубировали при 37 С 60 мин. После тщательной промывки в лунки вносили субстрат — 2,2 -азино-ди-(3-этил5 бензтиазолинсульфонат/6/1 (ABTS) в 0,05 М цитратном буфере с добавлением перекиси водорода и инкубировали на шейкере при комнатной температуре (21 С) в течение 30 мин, после чего оценивали результат на

10 спектрометре "Multiskan" (Flow, Великобритания} при длине волны 405 нм.

Получены следующие данные, выраженные в процентах от максимальной экстинкции (1,2 — 100%); (Fc}5 р -1000, IgM15 2%, lgG - 0%, IgA - 0, Таким образом, было показано, что гибридома ВЗ продуцирует моноклональные антитела, взаимодействующие с (Рс)5,ифрагментами lgM человека, но не с целой

20 молекулой IgM. Получен новый по определению, патентоспособный штамм клеток. (56) Левицкий В;А., Тоотс И.Э., Цибиногина

Т.Н. Изв. АН Латв, ССР, 1989, Й 12, с.

104-107, 25