Штамм гибридных культивируемых клеток mus musculus - продуцент моноклональных антител, используемых для диагностики болезни ибараки

 

Использование: иммунология, вирусология. Сущность изобретения; штамм гибридных клеток получают при слиянии перевиваемой мышиной миеломной линии Sp 2/0 - Ag 14 - 1 с лимфоцитами селезенки мыши линии BALB/c. иммунизированной очищенным вирусом болезни Ибараки (ВБИ). Штамм депонирован под номером ВСКК (П) 561 Д. Титр моноклинальных антител (МА) в культуральной жидкости (в ТФ ИФА) составляет 1 : 128 - 1 :152. При внутрибрюшинном введении мышам линии BALB/c клетки индуцируют образование асцитных опухолей с титром МА в асцитической жидкости до 1 : 20000. Антигенная специфичность к белку 146 кД ВБИ подтверждена методом радиоиммунопреципитации. МА проявляют активность в непрямом и сэндвич - вариантах ИФА с антигеном ВБИ и не вступают в перекрестную реакцию с гетерологичными антигенами Моноклинальные антитела специфичны , позволяют идентифицировать ВБИ от вируса катаральной лихорадки овец и могут быть использованы для изготовления диагностических препаратов. 1 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

ЬЭ

CO

СР

tA

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5027930/13 (22) 17.02.92 (46) 15.12.93 Бюл. Ио 45-46 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (72) Малоголовкин СА.; Черных АА; Новикова M.Á.;

Середа АД; Вишняков И.Ф. (73) Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS — ПРОДУЦЕНТ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ,-ИСПОЛЬЗУЕ—

МЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ БОЛЕЗНИ ИБАРА—

КИ (57) Использование: иммунология, вирусологи я.

Сущность изобретения: штамм гибридных клеток получают при слиянии перевиваемой мышиной миеломной линии Sp 2/Π— Ag l4 — 1 с лимфоцитами (19) RU (11) 2004589 С1 (51) 5 C12N500 селезенки мыши линии BALB/с, иммунизированной очищенным вирусом болезни И бараки (ВБИ).

Штамм депонирован под номером ВСКК (П) 561 Д.

Титр монокпональных антител (МА) в культуральной жидкости (в ТФ ИФА) составляет 1: 128 — 1: 152.

При внутрибрюшинном введении мышам линии

BALB/с клетки индуцируют образование асцитных опухолей с титром MA в асцитической жидкости до

1: 20000. Антигенная специфичность к белку 146 кД ВБИ подтверждена методом радиоиммунопреципитации. МА проявляют активность в непрямом и

"сэндвич" — вариантах ИФА с антигеном ВБИ и не вступают в перекрестную реакцию с гетерологичными антигенами Моноклональные антитела спе— цифичны, позволяют идентифицировать ВБИ от вируса катаральной лихорадки овец и могут быть использованы для изготовления диагностических препаратов. 1 табл.

2004589

Изобретение относигся к биотехнологии. а именно к штамму гибридных клеток, продуцируещему моноклональные антитела к вирусу болезни Ибараки (ВБИ), которые могут быть использованы в диагностических и научных исследованиях.

Известны штаммы гибридных клеток, секретирующие моноклональные антитела к вирусам эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО) и катаральной лихорадки овец (КЛО). Полученные моноклонапьные антитела позволяют идентифицировать вирусы ЭГБО и КЛО, которые являются антигенно родственными . не только между собой, но и с ВБИ. Поэтому для окончательного решения вопроса дифференциальной диагностики болезней, вызванных вышеуказанными вирусами, необходимо иметь монокпональные антитела к ВБИ, .которые бы идентифицировали

ВБИ от антигенно родственных вирусов.

Известны также гибридомы, секретирующие моноклональные антитела к ВБИ, которые получены путем слияния клеток миеломы РЗ х б3/Ag 8 с иммунными спленоцитами мышей линии BALB/с, Иммунизацию мышей проводят очищенным препаратом вируса болезни Ибараки путем внутримышечного введения с адьювантом

Фрейнда и последующей трехкратной интраперитонеальной иньекцией с недельным интервалом, Скрининг гибридом на предмет продукции антител ведут в непрямом иммунопероксидазном методе. В результате были получены 5 гибридом, продуцирующих анти-ВБИ антитела изотипов igG3, IgG2b и Ig62a к белкам с мол.м, 24 и 78 кД.

Однако не дается полной характеристики штаммов гибридных клеток и секретируемых моноклональных антител эа исключением иэотипа и полипептидной специфичности. Не показана воэможность использования полученных моноклональных антител для диагностики болезни Ибараки, а именно для выявления антигена в органах зараженных ВБИ животных, а также для обнаружения антител в сыворотках крови больных животных.

Как видно из вышеизложенного отсутствуют данные по получению штамма гибридных клеток, се кретирующего моноклональные антитела, которые бы использовались дпя диагностики болезни

Ибараки, Задачей изобретения является получение штамма гибридных клеток животных, продуцирующего моноклональн ые антитела к вирусу болезни Ибараки, используемые в диагностических целях.

Полученный штамм ВБИ х Sp 2/Π— 2D1o х х 90 имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.

Культура состоит иэ клеток округлой формы различной величины с ядром, занимающим большую часть клетки и расположенным эксцентрично. Каждое ядро содержит 2 — 4 ядрышка. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка. Кариотип соответствует мышиному. Модальный класс 89 хромосом (модальный класс для родительской миеломной линии Sp2/Π— Ag 14,1 72 хромосомы). В кариотипе клеток идентифицированы б-я и

12-я хромосомы, несущие структурные гены иммуноглобулинов.

Предлагаемый штамм обозначен как

ВБИ х Sp 2/О-2D>o 90 и хранится во Всесоюзной специализированной коллекции клеточных культур (ВСКК (П)) института ци5 тологии АН СССР под номером 561 Д.

Штамм гибридных клеток ВБИ х Sp

2/О-2D>o 90 получают путем гибридизации мышиной миеломной линии Sp 2/OAg14,1 с лимфоцитами селезенки иммунных мышей линии BALB/С, Для получения популяции иммунных лимфоцитов мышей иммуниэируют очищенным на 25% (m/÷)

"сахароэной подушке", препаратом вируса, который получают иэ культуральной жидкости зараженной ВБИ культуры клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК).

В первый день вводят внутрибрюшинно

200 мкл очищенного вируса (10 вир.част./мл) с равным объемом полного адьюванта Фрейнда. Через 10 дней инъекцию повторяют, .Спустя три недели вводят

250 мкл вирусного препарата внутривенно.

Гибридизацию проводят на 4-й день после введения бустер-дозы. Слияние клеток миеломы с пимфоцитами осуществляют в соотношении 1 10 в присутствии 50 полиэтипенгликоля с мол,м, 4000. Культивирование гибридных клеток ведут на среде, содержащей гиноксантин, аминоптерин, тимидин, Продукцию специфических антител определяют в непрямом варианте твердофаэного иммуноферментного анализа (ИФА) с антигенами вирусов болезни Ибараки и КЛО. При этом используют очищенный препарат вируса иммобилизованный на микропластины. Клоны, дающие положительную реакцию в ИФА только с ВБИ, отбирают и дважды клонируют в "мягком" агаре с целью получения стабильных штам40 мов клеток. Клон считают стабильным, если при последующем клонировании не менее

90% субклонов сохраняют продукцию антител, 2004589

Клетки обладают слабой адгезивной способностью. Тип роста — стационарная суспензия, Клетки легко снимаются при встряхивании или пипетировании, образуя мелкую однородную взвесь, Частота пассирования 1 раз в 2 — 3 дня. Коэффициент пересева 1:2 — 1 .3, Посевная доза 200-250 тысяч клеток в 1 мл.

Среда культивирования — модифицированная Дульбекко, среда Игла с содержанием 15 эмбриональной сыворотки теленка, 2 MM глутамина, 1 мМ пирувата натрия и 50 мкг/мл гентамицина. Оптимальный рН среды 6,8 — 7,2.

При хранении в условиях низких температур клетки сохраняют жизнеспособность в течение 6 мес при -70 С и неограниченно долго в жидком азоте (-196 С). Клетки хранят в пластиковых ампулах после 2-кратного клонирования в "мягком" агаре и пассирования на мышах линии BALB/с. Концентрация клеток при криоконсервировании составляет 5 — 10 млн/мл. Криоэащитная среда — ростовая среда с добавлением 40 эмбриональной сыворотки теленка и 10 диметилсульфоксида. Жизнеспособность клеток после замораживания 70 — 72 .

Контаминации бактериями, грибами и микоплазмами не обнаружено.

Гибридные клетки штамма ВБИ х $р

2/Π— 201о 90, сохраняют стабильную продукцию моноклональных антител в культуральной среде на протяжении 27 пассажей (срок наблюдения), При введении предлагаемых клеток в брюшную полость мышам

BALB/ñ в количестве 1 — 2 млн. на мышь, предварительно сенсибилиэированных пристаном, образуются асцитные опухоли.

Асцитические жидкости (3 — 7 мл на мышь) получают на 10 — 14 день после инокуляции клеток. Антитела, продуцируемые предлагаемым клоном, относятся к иммуноглобулинам класса G1, Иммуноглобулины выделяют солевой преципитацией с последующей очисткой на протеин-А сефарозе.

Методом радиоиммунопреципитации определена полипептидная специфичность к белку с мол.м. 46 кД.

Следовательно, штамм гибридных клеток ВБИ х Sp 2/Π— 20ю 90, секретирующий

45 моноклональные антитела к ВБИ, отличается от известного прототипа и обладает существенными преимуществами. Так предлагаемый штамм продуцирует иммуноглобулины изотипа 61 и обладает пол ипептидной специфичностью к ВП 46, Кроме того, данные моноклональные антитела могут быть использованы как для выявления антигена, так и для обнаружения антител в сыворотках больных животных.

Для выявления специфического антигена в суспензиях из органов зараженных лабораторн ых животных, а также иэ культуральной жидкости зараженной культуры клеток используют "сэндвич" — вариант

ИФА. При этом моноклональными антителами сенсибилизируют 96-луночные пластины (1 — 2 мкл на лунку) в течение 16 ч при 4 С, а затем вносят исследуемые пробы. Выявление антигена, связавшегося с подложкой, проводят пероксидазным коньюгатом на основе этих же моноклональных антител.

С целью выявления антител в сыворотках крови больных животных применяют двойной антительный "сэндвич" — вариант

ИФА (ДАС-ИФА) методом ингибирования, Для этого к иммобилизованным моноклональным антителам добавляют специфический антиген в рабочем разведении, а затем после инкубации и промывки вносят исследуемые сыворотки, По истечении времени инкубации (1 ч, 37 С) и последующей промывки вносят пероксидазный конъюгат с анти-ВБИ-моноклональными антителами.

О наличии специфических антител в сыворотках судят по подавлению свечения субстратного раствора.

Таким образом, штамм гибридных клеток ВБИ х Sp 2/Π— 201о 90 может быть использован для наработки моноклональных антител, специфичных к вирусу болезни

Ибараки. Продуцируемые штаммом моноклональные антитела позволяют идентифицировать ВБИ от КЛО и могут быть промышленно применимы для изготовления диагностических препаратов. (56) Sugiyama M, et ai, Res. In Vefer. Scl, 1989, 46, 2, р, 283 — 285.

2004589

Сравнительная характеристика моноклональных антител. секретируемых предлагаемым штаммом и прототипом

Составитель А.Семенихин

Техред.М.Моргентал Корректор M. Керецман

Редактор

Заказ 3379

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул, Гагарина, 101

Ф ормула изобретения Чент моноклональных антител, Штамм гибридных культивируемых кле- используемых для диагностики болезни ток Mus musculus ВСКК (И) N561 Д - проду