Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения моноклональных антител к igm человека

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5045256/13 (22) 23.0192 (46) 30.11.93 Бюп. f4 43-44 (71) Крымский медицинский институт (72) Ефетов KA„. Тэтин С.Ю:, Князева ОА. (Z3} Крымский медицинский институт (54) БТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ KJlH0K ЖИВОТНЫХ MUS IIIIUSCULUS L, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К!6М ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология иммуноглобулинов, разработка иммунодиагностических препа— ратов в биологии и медицине. Сущность изобрете(19) RU (11) 2ОО3687 С1 (51) 5 C12N5 00 С12Р21 00 ния: получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L продуцирующего моноклональные антитела (МКА) к IgM человека и его Fc-фрагментам, Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/с с клетками миеломы Sp 2/О Ае!4. МКА относятся к подклассу

IgG1 и специфически взаимодействуют с lgM чело. века и его (Fc)5 (Fc)5p — фрагментами. Концентрация МКА в культуральной жидкости составляет 5—

10 мкг/мл, а асцитной — 5 мг/мл. Продукция антител сохраняется в течение 25 пассажей в культуре и!5 пассажей на животных 1 табл.

2003687

Изобретение относится к биотехнологии и может быть. использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов M (IgM) человека, разработки иммунодиагностических препаратов в биологии и медицине, Известны мышиные моноклональные антитела (MKA) к lgM человека (1,2). Авторы (Ц для иммунизации испольэовали целые молекулы tgM. Авторы (2) описывают получение штамма, продуцирующего MKA к ртяжелым цепям IgM, по аналогичной схеме.

Но предпочтительнее применять для иммунизации Fc-фрагменты fgM; что исключает возможность получения антител к вариабельным участкам молекулы. Кроме того, каждая вновь полученная гибридома уникальна. МКА, продуцируемые разными гибридо мам и, различаются по многим параметрам, включающим специфичность к различным антигенным детерминантам, Поэтому использование панели МКА к IgM в комплексе расширяет возможности применения их в биохимических, иммунологических и клинических исследованиях.

Технический результат изобретения заключается в получении гибридного штамма, продуцирующего MI<, A к 1дМ человека и.его

Fc-фрагментам.

Штамм получают следующим образом.

Мышей линии BAlb/ñ иммуниэируют введением в перитонеальную область 100 мкг препарата (Fc) 5и -фрагмента fgM человека (полученного гель-фильтрацией трипсинового гидролиэата IgM, выделенного из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема) в 0,005 M фосфатном буферном растворе с 0,15 M NaCI, рН 7,4 (PBS) с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию повторяют через месяц, но антиген вводят без адъюванта; Через 4 недели после второй иммунизации мышам вводят 100 мкг препарата внутривенно. Через 3 дня у животных определяют титр антител к Ig M методом иммуноферментного анализа. Мышь с лучшим иммунным ответом используют для получения гибридомы. Для этого l0 клеток селе8 зенки иммунной мыши гибридизуют с 4 ..10

7 клеток миеломы Sp 2/0 Ag14 в присутствии

50 -ного раствора полиэтиленгликоля с мол.м, 4000 (Merck, ФРГ), После гибридизации клетки высевают в 96луночные планшеты по 10 клеток на лунку, 8 качестве питающего слоя используют перитонеальные макрофаги мыши, которые высевают по

10 клеток на лунку за сутки до гибридизации. Гибридому клонируют 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 32 клетки на 96луночный планшет), высевая клетки на слой перитонеальных макрофагов. После второго клонирования более 90% полученных субклонов продуцируют антитела к IgM человека. Наиболее продуктивный

5 клон выводят в массовую культуру и обозначают IA4, Культуральные признаки. Способ культивирования в пластиковых флаконах на 50—

250 мл. Посевная доза 5 10 клеток на 1 мл, 10

Кратность рассева 1:5, время субкультиви20 ксантин-гуанинфосфорибоэилтрэнсферазе

Клетки выращивают в атмосфере 5% СО2 при 37оС

Морфологические признаки, Тип роста штамма суспензионный, клетки округлой формы, в основном одиночные, некоторые группы клеток образуют кластеры. Гибридома вызывает образование смешанных асцитных и солидных опухолей при прививке в перитонеальную полость.

Культивирование в организме животноro. Для выращивания гибридомь< в асцитной форме клетки (по 10 ) вводят в брюшную полость мышей BALB/с, которым предварительно (за 7 — 10 сут.} внутрибрюшинно инъецируют тетраметилпентадекан, Опухоли образуются через 10-14 дней после прививки, Характеристика полезного продукта.

МКА, продуцируемые штаммом IA4, относятся к fg CI подклассу, специфически связы40 вают fgM и (Fc) 5,и-фрагменты lgM человека, Принадлежность к подклассу fgG определяют при помощи преципитирующих сывороток против IgG мыши разных подклассов (Sfgma, США) методом радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони, Взаимодействие антител с (Fc) Qc - и fg M человека определяют методом иммуноферментного анализа.. . Продуктивность штамма, стабильность

50 .антител. Секоеция МКЛ через 3 — 4 дня культивирования "ин витра" составляет 5-10 мкг/мл, в асцитной жидкости — 5 мг/Mil.

Контроль продуктивности осуществляется с помощью иммуноферментного анализа, титр 1/5000. Продукция антител сохраняется в течение 25 пассажей в культуре и 15 пассажей нэ животных.

Контроль контаминации. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длирования 3 — 4 дня, Среда для культивирования — RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, по 2 мМ глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пеницил15 лина и стрептомицина. В первые 3 недели после гибридизации в среду добавляют 10 M гипоксантина, 4 10 M аминоптерина и 1,6

10 М тимидинэ, тэк как клетки миеломы

Sp 2/О Ag14 дефектны по ферменту гипо2003687 тельном наблюдении и посевах на питательные среды, Заражение микоплазмой не выявлено при окрашивании красителями на

ДН К.

Способ криоконсервирования, Для длительного хранения клетки штамма эамораживают в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10 диметилсульфоксида. Режим замораживания; сутки при -70 С, затем ампулы с клетками переносят в жидкий азот. Размораживают клетки, перенося ампулу из жидкого азота в водяную баню на

37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70 — 80 по окрашиванию трипановым синим.

Пример. Гибридомные клетки штамма !

А4 помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 10 клеток в 5 мл среды

RPM1 — 1640 с добавлением 10 фетальной сыворотки, по 2 MM глутамина и пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Клетки культивируют 3 — 4 дня при 37 С в атмосфере, содержащей 5 СОг. Культуральную среду собирают, центрифугируют

10 мин при 800об/мин. Супернатант, содержащий МКА к lgM человека, используют в иммуноферментном анализе. В качестве антигенов вносят различные иммуноглобулины (выделенные из сыворотки крови здоровых людей и больных миеломной болезнью методом переосаждения сернокислым аммонием с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе): IgG дон, 196! Куэ, IgGI Бог, IgG2 Рыб, igG2 Боб, ig63 Дал, Ig64 Жел, IgG4 Бер, IgG4 б/н, lgA, а также IgM (выделенный из сыворотки крови больного болезнью Вальденстрема переосаждением бидистиллированной водой с последующей гель-фильтрацией) и (Fc) 5и -фрагменты IgM человека (полученные гель-фильтрацией трипсинового гидролизата IgM). Антигены разводят до концентрации 10 мкг/мл в 0,05

M йа-карбонатном буфере, рН 9,2 и вносят,,по 50 мкл в лунку на 96-луночные пластико вые планшеты. Инкубируют в течение 1 ч при 37 С, затем сливают и вносят по 100 мкл в лунку 1 раствор бычьего сывороточ5 ного альбумина на 1 ч при 37 С. После окончания инкубации раствор альбумина сливают., планшет промывают холодной водой и PBS с 0,05% таином (PBST), вносят супернатант культуральной среды по 50 мкл

10 влунку и инкубируют при,37 С. Череэ1 ч все сливают, промывают холодной водой и

PBST {PBS с 0,057, таином), добавляют по

50 мкл коньюгата кроличьих антител против

IgG мыши с пероксидазой в разведении

15 1:500 в растворе PBST и инкубируют при

37 С 1 ч. После тщательной промывки в лунки вносят 0,4 MM раствор субстрата-2,2 — азино-ди- (3-зтилбензтиазолинсульфонат (6)) (АВТО) в 0,05 M Na-цитратном буфере, 20 рН 4,0 с добавлением перекиси водорода до конечной концентрации 0,01% и инкубируют на -шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего оценивают результат на сптектрофотометре

25 "Multiskan" (Flow, Великобритания) при длине волны 405 нм.

Получены следующие данные, выраженные в процентах от максимальной зкстинкции (1,6 — 100 ), приведенные в таблице, 30

Таким образом, данные, представленные в таблице, показывают, что гибридома

lA4 продуцирует МКА, специфически взаимодействующие с igM человека и их Fc35 фрагментами. (56) 1. Левицкий В.А., Тоотс И.Э. Цибиногина Т.Н. Получение новых линий гибридных клеток, секретирующих

40 моноклональные антитела к человеческим иммуноглобулинам класса M,: Изв, АН

Латв.ССР, 1989, М 12, с. 104 — 107.

2. Авторское свидетельство СССР

В 1493668, кл, С 12 N 5/00, 1989.

2003687

Формула изобретения

Составитель К.Ефотов

Техред М.Моргентал

Корректор С.Юско

Редактор Л.Павлова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3309

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus muscu)us L. ВСКК(П) й

473 D, используемый для получения моно- клональных антител к IgM человека.