Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l. - продуцент моноклональных антител к igg человека

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5028465/1 3 (22) 24.02.92 (4@30.11.93 6еп. Ма 43-44 (71) Крымский медицинский институт (72) Князева ОА; Ефетов КА; Тэтин С.Ю„Троицкий

Г.в. (73) Крымский медицинский институт (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЪ|Х MUS MUSCUlUS т — ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

К IGG ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, иммунопогия.

Штамм попучатот при гибридизации кпеток селе(19) RU (11) 2ООЗ.686 III (51)5 CIXNS ОО C lXNS 1б зенки мышей BALB/с, иммунизированных препаратом IgG человека, и кпетками миепомной линии $р

2/О Аф4. Штамм обозначен 2HIIF9 и хранится под номером ВСКК(П) 568Д. Концентрация антител в купьтурапьной жидкости достигает 40 мкг/мп.

Секретируемые гибридомой монокпонапьные антитела взаимодействуо с tgG человека, но не с Fab- u

Fc-фрагментами. Антитела могут использоваться дпя структурных и функционапьных исследований

tgG человека, разработки иммунодиагностических и иммунотеравевтических препаратов в биологии и медицине.

2003686

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для структурных и функциональных исследований иммуноглобулинов Ci (lgG) человека, разработки иммунодизгностических и иммунотерзпевтических препаратов в биологии и медицине. Получение больших количеств таких антител возможно только с помощью гибридомной технологии, В литературе имеются сообщения о получении мышиных антител к IgG человека (1,21. Но любая вновь полученная гибридома является новой по определению, так как синтезируемые ею моноклонзльные антитела индивидуальны по зффинности к данному антигену, первичной структуре и кзк следствие этого — физико-химическим свойствам. Получение набора антител к разным антигенным детерминантам иммуноглобулина позволяет использовать целый спектр вариантов иммунологических методов.

Для гибридизации использовали клетки миеломной линии NS1 (2), которые синтезируют легкие цепи иммуноглобулинов, способные встраиваться в молекулы антител, 4Т0 может приводить к инактивации части антител и соответственно снижать эффективность применения для иммуноферментного анализа. Кроме того, моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2HIIF9, в смеси с моноклональными антителами 2FIIE9 (против IgG человека) или с моноклонзльными антителами 3H2D2 (против к-- легких цепей иммуноглобулинав человека) обладают способностью к преципитации с иммуноглобулинзми человека G.

Целью изобретения является получение гибридомного штамма, продуцирующего маноклонзльные антитела к IgG человека, пригодные для использования в различных видах биохимических и иммунологических исследований.

Происхождение штамма. Мышей линии

BALB/с иммунизировали внутрибрюшинным введением 100 мкг IgG человека (выделенный из сыворотки крови больного миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-трисакриле М) в забуференном фосфзтзми физиологическом растворе с полным адьювантом Фрейндз. Иммунизацию повторяли через месяц таким же количеством антигена, но без адъювантз. Через месяц после второй иммунизации мышам вводили 100 мкг препарата внутривенно, В процессе иммунизации у животных с помощью иммуноферментного анализа определяли титр антител к IgG, используемому для иммунизации. Для этого делзли забор крови иэ хвостовой вены. Для гибридомного слияния отбирали животных с максимальным титром антител. 10 клеток в селезенки иммунной мыши гибридиэовали с 4 10 клеток миеломы $р.2/О Ag14 в присутствии 50 -ного раствора полиэтиленгликоля с мол,м. 4000 (Merck, ФРГ). После гибридизации клетки высевали в

96-луночные планшеты по 10 клеток на лун5 ку, В качестве питающего слоя использовали перитонеальные макрофаги мыши, "0 которые высевали по 10 клеток на лунку за

4 сутки на питательной среде ИРМИ640 с добавлением 20 Д фетальной бычьей сыво7ротки, 10 М гипоксантина. 4 10 М аминоптерина и 1,6 10 М тимидина. Гибридомы, выявленные иммуноферментным анализом к lgG человека, клонировали 2 раза методом лимитирующего разведения (из расчета 1 клетка на 3 лунки 96-луночного планшета). После второго клонирования бо20 лее 80 полученных субклонов продуцировали антитела к IgG человека. Продукция антител сохранялась в течение 30 пассажей в культуре и 23 пассажей на животных, Среда для культивирования — среда НРМИ640

25 с 10(, фетальной бычьей сывороткой, 2 мМ глутамина, 2 мМ пирувата, по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина. Посевная доза — 10 клеток в 1 мл, Через 2-3 дня

5 концентрация антител в культуральной жид30 кости достигала примерно 40 мкг/мл. Контаминации бактериями, грибками и микроплазмами не обнаружено, Для длительного хранения гибридомные клетки могут быть заморожены в фе3-" тальной бычьей сыворотке с добавлением

10ь диметилсульфоксида, Способ криоконсервирования — 1 сут. при -70 С. затем клетки переносятся в жидкий азот.

Размораживают клетки, перенося ампулу

40 жидкого азота в водяную баню на 37 С.

Наработку моноклональных антител проводили культивированием гибридомных клеток In vlvo — на мышах линии BAI B/с (предварительно обработанных внутрибрю45 шинно тетраметилпентадеканом) в количестве 10 клеток на мышь. Опухоли образовывались через 10-14 дней после прививки. Секреция антител клетками гибридомы, выращиваемыми в асцитной фор50 ме, сохранялась в течение 23 пассажей на животных.

Гибридома получила условное название

2НИРэ. Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом, относятся к первому

55 подклассу мышиных !96 и взаимодействуют с IgG человека. Данные антитела в смеси с моноклональными антителами 2FIIEII (против lgG человека) или монаклональными антителами 3H2D2 (против к -легких цепей

2003686

Формула изобретен и я

Составитель О.Князева

Техред M.Ìoðråíòàï

Корректор О.Густи

Редактор Л.Павлова

Заказ 3308

Тираж Подписно

НПО Поиск Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 иммуноглобулинов человека) обладают способностью к преципитации с 196 человека.

Принадлежность к подклассу определяли при помощи преципитирующих антисывороток к мышиным lgG разных подклассов (Sig ma, США) методом двойной рэдиал ьной иммунодиффузии по Оухтерлони. Взаимодействие с IgG человека определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа. Способность к преципитэции выявляли также по Оухтерлони.

Пример 1. В твердофазном иммуноферментном анализе использовали специальные плоскодонные 96-луночные планшеты. В ячейки вносили по 50 мкл антигены: различные моноклональные иммуноглобулины (выделенные из крови больных миеломной болезнью методом ионообменной хроматографии) и для контроля — бычий сывороточный альбумин в концентрациях 10 мкг/мл в бикарбонатном буферном растворе, Инкубировали в течение 60 мин при 37 С, затем сливали и вносили по 100 мкл в лунку 1 -ный раствор сывороточного альбумина на 60 мин при

37 С. После окончания инкубации раствор альбумина сливали, планшет промывали холодной водой и забуференным раствором с

0,057 таином (PBST), вносили культуральную среду (которую получали, помещая гибридомные клетки по 5 10 в 5 мл среды

RPMI-1640 с 10-",ь фетальной сывороткой, Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК(П) N

2 мМ глутамина, 2 мМ пируватэ. по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина на 2-3 дня в СО>-инкубатор) по 50 мкл в лунку и инкубировали при 37"С. Через 60 мин все

5 сливали, промывали холодной водой и

RBST, добавляли по 50 мкл коньюгата антител к IgG мыши с пероксидазой (Sigma, США) в разведении 1:500 в растворе PBST и инкубировали при 37 С 60 мин, После тща10 тельной промывки в лунки вносили субстрат — 2,2 -азино-ди-(3-зтилбензтиазолинсульфонат/6/)(ABTS) в 0,05 М цитрэтном буфере с добавлением перекиси водорода и инкубировали на шейкере при комнатной темпера15 туре (21 С) в течение 30 мин. Результаты оценивали нэ спектрофотометре

"Multiskan" (РЬв, Великобритания) при длине волны 405 нм, Получены следующие данные, выра20 женные в процентах от максимальной зкстинкции (1,0-100;ь): lgG-1007;, lgG2-100, IgG3-100 j,, IgG4-86, IgG суммарный100, IgA-0, IgM-0 $, Fab-, Fe- фрагменты

IgG-0ОА.

25 Таким образом, было показано, что гибридома 2HliF9 продуцирует моноклональные энтителэ. взаимодействующие с IgG человека, но не с Fab- u Fc- фрагментами

tgG.

30 (56) 1. Jefferls R. etal.. Immunol. Letters, 1985, 10, 223.

2. Lowe3. et at, J. I mmunol „1982. 47, 221.

568 0 - продуцент моноклональных антител к IgG человека.