Способ обнаружения диатомовых водорослей в крови утонувших

 

Способ относится к области медицины, в частности к судебной медицине. Способ характеризуется тем, что центрифугируют отобранные порции крови, удаляют надосадочную жидкость, промывают осадок путем повторного центрифугирования до получения бесцветной прозрачной надосадочной жидкости, ресуспензируют осадок и его микроскопируют для обнаружения диатомовых водорослей, отобранные образцы крови перед центрифугированием предварительно обрабатывают хромовой смесью. Способ обеспечивает повышение достоверности анализа. 1 табл.

Предлагаемое изобретение относится к области судебной медицины, в частности может использоваться при доказательствах причины смерти от утопления в воде.

Известны различные способы выделения планктона из трупного материала для доказательства утопления. При этом наиболее ценными в диагностическом отношении являются диатомовые водоросли, имеющие кремнеземную оболочку - панцирь. Определение планктона проводится путем многостепенного центрифугирования и разрушения органического вещества внутренних органов трупа (обычно используется почка) крепкими кислотами, пергидролем и другими окислителями. Чаще применяется пергидрольный способ разрушения органов по Губареву в модификации Максимюк.

Однако обработка материала крепкими кислотами вызывает разрушение не только мешающих органических веществ, но и самих диатомовых водорослей в первую очередь, имеющих тонкий кремнеземный панцирь. Тонкопанцирность диатомового планктона является, в частности особенностью маломинерализованных водоемов Восточной Сибири.

Известен способ выделения планктона из крови смесью жидкостей с различным удельным весом, включающий отстаивание гемолизата под покровным стеклом с целью осаждения элементов планктона, а также исследование наложений на интиме крупных артерий под микроскопом.

Недостатком данного способа является большое количество времени, затрачиваемого на анализ, его трудоемкость.

Другой способ выделения диатомового планктона из крови осуществляется с помощью мембранных фильтров. По данной методике трупная кровь разводится дистиллированной водой. В воду добавляется несколько капель неразведенного аммиака. Гемолизат наливают на мембранный фильтр, создают разряжение с помощью вакуума, которое поддерживают в течение 2-3 часов. После чего микроскопируют фильтр.

Этот метод также занимает много времени. При этом количество профильтрованной крови ограничивается небольшим объемом, поскольку поры фильтров быстро забиваются органической примесью. Чтобы увидеть водоросли на фильтре, требуется их дополнительная обработка, включающая высушивание фильтров, отмывание и просветление иммерсионным маслом.

Ближайшим аналогом является способ выделения планктона из основной кости и крови с разрушением кровяных телец аммиаком.

Кровь помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 5 минут при 1000-1500 об/мин. Надосадочную жидкость удаляют путем отсасывания пипеткой, а осадок несколько раз промывают 5-10% раствором аммиака путем центрифугирования до получения прозрачной надосадочной жидкости. Надосадочную жидкость осторожно отсасывают пипеткой, оставляя над осадком ее тонкий слой в 1-3 мм. Осадок ресуспензируют и в виде капель переносят на обезжиренное предметное стекло, на котором его высушивают при комнатной температуре или при нагревании до 70-80^oC. Далее, на препарат помещают каплю канадского бальзама или 15% раствор полистирола и накрывают покровным стеклом. Препарат микроскопируют и подсчитывают в них обнаруженные створки диатомового планктона.

Недостатком прототипа является присутствие в осадке органической примеси. После центрифугирования необработанной крови в осадок наряду с предполагаемыми диатомовыми водорослями выпадают кровяные тельца. Они остаются в нем после их промывания аммиаком в разрушенном виде. Это усложняет проведение идентификации водорослей под микроскопом и понижает достоверность анализа.

Целью изобретения является повышение достоверности анализа.

Поставленная цель достигается тем, что в способе обнаружения диатомей в крови утонувших, включающем центрифугирование отобранных порций крови, удаление надосадочной жидкости, промывание осадка путем повторного центрифугирования до получения бесцветной прозрачной надосадочной жидкости, ресуспензирование осадка и его микроскопирование для обнаружения диатомей, отобранные образцы крови предварительно обрабатывают хромовой смесью.

Обработка хромовой смесью удаляет органическую примесь, чтобы в дальнейшем она не содержалась в возможном осадке из кремнеземных панцирей диатомовых водорослей и не мешала их обнаружению. Следует указать, что хромовая смесь в отличие от концентрированных кислот является более мягким окислителем. Она сжигает кровяные тельца и не разрушает кремнеземные панцири диатомовых водорослей, в том числе и тонкостенные. Способ осуществляется следующим образом. Для проведения анализа достаточно иметь 10-15 мл крови. Кровь берут из сердца и прилегающих к нему крупных сосудов. Сжигание органического вещества проводят в центрифужных пробирках хромовой смесью. Хромовую смесь готовят следующим образом: 1 г бихромата калия (K₂Cr₂O₇) добавляют к 100 мл теплой концентрированной серной кислоты и нагревают при перемешивании до полного растворения. Приготовленную для экспертизы кровь разливают поровну в центрифужные пробирки, заполняя каждую приблизительно на 1/3. Затем пробирки доливают доверху хромовой смесью и выдерживают 2-3 мин. Содержимое пробирок осторожно перемешивают тонкой стеклянной палочкой, затем центрифугируют для осаждения диатомовых панцирей при 2000 об/мин в течение 3-5 мин. При этом часть органической массы сжигается, а оставшаяся масса частично выпадает в осадок и частично всплывает, концентрируясь у поверхности в виде пленки. Необходимо удалить эту пленку, что можно сделать стеклянной палочкой. Далее пипеткой с баллоном и резиновой грушей отсасывают жидкость. К выпавшей в осадок органической массе, в которой могут находиться диатомовые водоросли, вновь добавляют хромовую смесь и повторяют уже указанные операции в изложенной последовательности 2 - 3 раза до удаления основной органической массы, мешающей нахождению панцирей диатомовых водорослей. После того, как будет сожжено не менее 90% органического вещества, что установлено опытным путем, материал отмывается в дистиллированной воде от хромовой смеси путем повторного центрифугирования. При отмывании, также как и при сжигании, важно осторожно отсосать жидкость, чтобы не задеть возможного осадка из панцирей диатомовых водорослей, которые простым глазом, конечно, не видны. В пробирке оставляют примерно 0,3 - 0,5 мл жидкости. При необходимости отмывание повторяют в 2 - 3 повторностях. После этого необходимо возможный осадок из панцирей диатомовых водорослей собрать в одну центрифужную пробирку. При этом ополаскивание осадка в каждой пробирке проводится небольшим количеством дистиллированной воды. Слитая в одну пробирку жидкость центрифугируется, осторожно отсасывается пипеткой, а оставшийся на дне пробирки небольшой ее объем (0,3-0,5 мл) взмучивается, целиком переносится на предметное стекло, накрывается покровным стеклом и полностью просматривается под микроскопом с целью определения наличия в нем панцирей диатомей.

Пример. В апреле 1992 г. из реки Ангары, в районе ее истока, было извлечено тело. Нам была передана кровь для анализа. Кровь была взята из сердца и прилегающих к нему крупных сосудов в объеме 20 мл. Обработав ее предложенным нами способом, обнаружили в ней панцири диатомовых водорослей. Это были типично байкальские виды рода Aulacoseira, обитающие в планктоне, и панцири видов рода Gomphonema, которые являются обитателями дна и обрастаний, поселяясь на затопленных предметах. Обнаружение диатомовых водорослей в крови утонувшего позволило сделать заключение об аспирационном типе утопления.

Эта работа была проведена нами в связи с тем, что эксперты Иркутского областного бюро для обнаружения диатомовых водорослей в трупах использовали целиком почку. Разрушение почки проводили путем ее кипячения в смеси концентрированных кислот. В результате таких анализов планктон обнаруживался лишь эпизодически. Например, у лиц, погибших от утопления в 1989-1990 гг. в состоянии алкогольного опьянения на момент смерти, из 60 случаев диатомовые водоросли были обнаружены лишь дважды. Как известно, в таких случаях утопление чаще развивается по аспирационному или смешанному пато-танатогенетическому механизму и процент обнаружения диатомовых водорослей у данных лиц должен быть близким к максимальному.

Анализируя этот метод с точки зрения диатомологов, мы предположили, что первая и основная причина отсутствия диатомовых створок в материале, полученном в результате экспертизы, заключается в использовании указанного метода без учета особенностей региона (тонкопанцирность большинства планктонных диатомей). По нашему мнению, большая часть створок при длительной обработке в концентрированных кислотах разрушается. Это известно из практики диатомового анализа. Для подтверждения высказанного мнения мы сравнили полученные разными методами результаты анализов по обнаружению диатомовых водорослей, используя органы и кровь одного и того же трупа, извлеченного из воды. Первый отрицательный результат был получен экспертами Иркутского областного бюро, проводивших анализ методом кипячения почки в концентрированных кислотах (табл.).

Нами был проведен анализ крови путем обработки ее мягким окислителем, не разрушающем тонкие панцири диатомовых водорослей, - хромовой смесью и получен положительный результат. В крови были найдены створки (две створки образуют панцирь) видов рода Aulacoseira, Cocconeis, Gomphonema (см. табл.).

Мы также провели анализ крови методом ее обесцвечивания аммиаком и убедились, что использование хромовой смеси для обработки крови дает лучший результат. При использовании аммиака органика только обесцвечивается, но из осадка не удаляется и при микроскопировании маскирует прозрачные створки диатомовых водорослей, что значительно понижает достоверность анализа или приводит к получению отрицательного результата.

Формула изобретения

Способ обнаружения диатомовых водорослей в крови утонувших, включающий центрифугирование отобранных порций крови, удаление надосадочной жидкости, промывание осадка до получения бесцветной прозрачной надосадочной жидкости, ресуспензирование и микрокопирование препаратов, отличающийся тем, что отобранные образцы перед центрифугированием предварительно обрабатывают хромовой смесью.

РИСУНКИ

Рисунок 1