Способ получения -норлейцин13-мотилина

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

1Щ 562l93

Соав Свеетскик

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (51) М. Кл.а С 07С 103/52 (22) 3 аявлено 27.03.74 (21) 2013928/04 (23) Приоритет — (32) 27.03.73 (31) P 23 15271.8 (33) ФРГ

Опубликовано 15.06.77. Бюллетень;¹ 22

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 547.964.4..07(088.8) по делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 01.11.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Эрих Вюнш, Герхард Вендльбергер, Эрнст Егер, Регине

Шарф, Карл-Хайнц Даймер и Ханс Штокер (ФРГ) Иностранная фирма

«Макс-Планк-Гезельшафт цур Фердерунг дер

Виссеншафтен е. ф.,» (ФРГ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-НОРЛЕЙЦИН-13-МОТИЛИНА

Н вЂ” Phe-Ча1 — Pro — 31,е Phe Thr — Туг — С1ц-С1ы —.Хоп — GLIl ! i ) (2) (5) (é) (5) (á) (7) (8) (9) (10) (11? г9 — И1е — С-1и — Ии — dgs-Иu Arg Asn guS-С-1п-С1п — (1И (г) (13) 1 1- 1) (15) (iG) (è) (15) (19) (гп) (г1) (гу?

Изобретение относится к способу получения неописанного в литературе аналога приИзвестен способ получения полной последовательности секретина, заключающийся в том, что составляют отдельные фрагменты, которые связывают друг с другом с помощью дициклогексилкарбодиимид - N - оксисукцинимида. В качестве защитных групп используют легко отщепляемые ацидолизом группировки.

Однако в литературе нет сведений о способе получения соединения формулы 1 или каких-либо других аналогов мотилина.

Согласно изобретению описывается способ получения соединения формулы I, заключающийся в том, что получают защищенные отцельные фрагменты:

2 родного докозапептида мотилина — L-норлейцин-13-мотилпна общей формулы 1 фрагмент I — аргинил (бромгидрат) — аспарагинил - Ne — трет. - бутилоксикарбонил5 лизил-глицил — глутамин - трет, - бутпловый эфир (аминокислоты 18 — 22), фрагмент II — Na - бензилоксикарбонилглутамил - у - трет. — бутиловый эфир) - глутамил- (у-трет.-бутиловый эфир) -Ne-трет. - бу10 тилоксикарбонил-лизил-глутаминовая кислота-v-трет.-бутиловый эфир (аминокислоты

14 — 17), фрагмент III — Na - бензплоксикарбонилN6,Ne - дибензилоксикарбонил- аргинил-нор15 лейцин (аминокислоты 12 — 13), фрагмент IV — NQ - оензилоксикарбонплглутамил - (; - трет.-бутиловый эфир) - лейцил-глутампн (аминокислоты 9 — 11), 562193

65 фрагмент V — О-трет. — бутил - треонил-Отрет.-бутил-тирозил-глицин (аминокислоты

6 — 8), фрагменты VI — Na-трет. - бутилоксикарбонил-фенилаланил - валил — пролил - изолейцил - фенилаланин (аминокислоты 1 — 5); полученные фрагменты 1 — VI конденсируют друг с другом известным способом, например модифицированным карбодиимидным, с помощью дициклогексилкарбодиимид - Nоксисукцинимида; из полученного защищенного полипептида (аминокислоты 1 — 22) удаляют защитные группы при помощи трифторуксусной кислоты с последующим выделением целевого продукта известным спосооом.

В примерах применяются следующие, обычные в химии пептидов, сокращения и символы: сокращения аминокислот, у которых, как правило, речь идет о трех начальных буквах, числовые данные в скобках, которые не имеют никакого другого дополнения, если соответствующее соединение еще раз не появляется в форме другого производного, которое имеет подряд дополнения а, b, с, и т. д., если исходят из а и получают другие производные, 1 — конфигурация, Z — бензилоксикарбонильный радикал, ВОС вЂ” третичный бутилоксикарбонильный радикал, DCCD — способ с дициклогексилкарбодиимидом, ЭССЭ/HOSU — способ с дициклогексилкарбодиимид-N-оксисукцинимидом, DCCD/HOBt — способ с дициклогексилкарбодиимид-оксибензтриазолом, РАМ вЂ” фосфоразо-метод, SU — радикал N-оксисукцинимида, NP — радикал р-нитрофенила, tBu — радикал третичного бутила, DBSI — дибензолсульфимид в качестве солеобразователя, Ме — метильный радикал, TFE — трифторуксусная .кислота, 1. У. — «в вакууме».

Пример 1. Получение фрагмента 1 (18—

22): Н вЂ” Gln — OtBu (22в), полученный из

Z — Gln — ОН (22а) этерификацией третичным бутиловым эфиром уксусной кислоты с последующим удалением гидрогенолизом бензилоксикарбонильной защитной группы, соединяют с Z — Gly — OSu (21) в Z — Gly — Gln— — Ot Bu (21 — 22а); полученный после удаления гидрогенолизом N-защитной группы

Н вЂ” Gly — Gln — Ot Bu (21 — 22в) соединяют с

Z — Asn — Lys (ВОС) — ОН (19 — 20) по известному способу с DCCD/HOSu в 2 — Asn — Lys (ВОС) — Gly — Glu — OtBu (19 — 22а) . Голов1ую компоненту (19 — 20) можно было получить аминоацилированием Н вЂ” Lys (ВОС)—

ОН (20) с Z — Asn — ONP (19) при обычных условиях.

Зо

Удаление защитной группы с Z — Asn — Lys (В ОС) — Gly — G1n — OtB u (19 — 22а) каталитическим гидрогенолизом дает производное тетрапептидного сложного эфира (19 — 22в), которое соединяют с Z — Arg (б,а — Zq) ONP (18) в Z — Arg (б, ж — Zq) — Asn — Lys (ВОС)—

G1y — G 1 n — OtBu (18 — 22а) .

Эксперимент проводят следующим образом.

А. Дибензолсульфимидная соль L-глутамин-трет.-бутилового сло кного эфира.

103 г бензилоксикарбонил-глутамин-трет.бутилового сложного эфира, полученного по известному способу, в 2 л метанола каталитически гидрируют (над палладиевой чернью) известным образом при добавлении 91 г дибензолсульфимида в 500 мл метанола при рН

3,5.

Фильтрат упаривают в вакууме, а затем азеотропной отгонкой с бензолом; из этилацетатного раствора маслянистый остаток при добавлении диэтилового эфира кристаллизуется. Из метанола/диэтилового эфира получают кристаллы с т. пл. 135 — 136 C; (а) =

=+10,78 (с 1,0; метанол), Выход 146 г (97 /о от теории).

Б. Бензилоксикарбонил--глицил-I -глутаминтрет.-бутиловый сложный эфир.

115 г дибензолсульфимидной соли 1 -глутамин-трет.-бутилового сложного эфира, суспендированного в 800 мл дихлорметана, смешивают при перемешивании с 32,2 мл триэтиламина и после этого с 70,5 г бензилоксикарбонил-глицин-N-оксисукцинимидного сложного эфира.

После перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре, концентрирования в вакууме, экстр агирования масла этилацетатом, промывки этого раствора, как обычно, раствором лимонной кислоты, бикарбоната калия и водой, сушки над сульфатом натрия и упаривания в вакууме получают масло. Выход 87 г (93 /о от теории).

В. Дибензолсульфимидная соль глицил-1глутамин-трет.-бутилового сложного эфира.

80 r бензилоксикароонил-глицил - 1-глутамин-трет.-бутилового сложного эфира (п. Б) в 900 млметаноладеацилируют (60гдибензолсульфимида) гидрогенолизом, как описано в п, А. Получают маслянистый остаток, который кристаллизуется при растирании с петролейным эфиром; т. пл. 92 C (с разложением), (а) = — 8,5 (с 1,0; метанол). Выход 110 г (98 от теории).

Г. Бензилоксикарбонил - 1 - аспарагинилNe,-трет. — бутилоксикарбонил-I -лизин.

51 г Хв-трет.-бутилоксикарбонил - I -лизина переводят в бензилтриэтиламмонийную соль и после этого перемешивают в 700 мл диметилформамида с 81 г бензилоксикарбонил-1аспарагин-4-нитрофенилового сложного эфира в присутствии 1 эквивалента пиридина в течение 48 ч при 20 С. Остаток после упаривания в вакууме одновременно обрабатывают этилацетатом и раствором бисульфата калия. Образующийся осадок отфильтровывают

562193 и перекристаллизовывают из этанола/петролейного эфира, т. пл. 174 — 175 С (с разложением); (а)" =+ 13,8 С (с 1,0; пиридин).

Выход 70 г (71% от теории).

Д, Бензилоксикарбонил - 1. - аспарагипилКе-трет.-бутилоксикарбонил-l - лизил - глицил-I -глутамин - трет, - бутиловый сложный эфир.

К 61,5 г дибснзолсульфимидной соли глицил-1 - глутамин - трет, — бутилового эфира и 54,5 r бензилоксикарбонил-1 -аспарагинилКе-трет.-бутилоксикарбонил — L - лизина в

700 мл диметилформамида добавляют при перемешивании при 0 С сначала 15,5 мл триэтиламина и через 15 мин по 13 r N-оксисукцинимида, и 23 r N,N-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают 3 ч при 0 С, а затем еще 24 ч при комнатной температуре. Фильтрат упаривают в вакууме, ос аток кристаллизуют пои обработке этилацетатом. Перекристаллизацию производят из метанола/воды и изопропанола/этилацетата, т. пл, 155 — 156 С; (el = — 20,8 (с 1,0; этанол) . Выход 63 r (73% от теории) .

Е. Хлоргидрат I -аспарагинил-Кв - трет.бутилоксикарбонил-1 - лизил - глицил - Lглутамин-трет.-бутилового эфира.

47,5 г бензилоксикарбонил-1 -аспарагинилКв-трет.-бутилоксикарбонил - L - лизил-глицил-L — глутамин-трет.-бутилового эфира (по (п. Д) в 800 мл метанола гидрируют при статических условиях величины рН (pH= 5,5;

25,2 мл 2,5 н. раствора хлористого водорода в метаноле) . Остаток после упаривания фильтрата в вакууме при растирании с диэтиловым эфиром дает б сцветный порошок, т. пл. 98 С; (аl =+9,5 (с 1,0; метанол).

Выход 40 г (97%).

5К. Ка, Кб, Ко-трибензилоксикарбонил-Iаргинил-L-аспарагинил-Кв - трет. — бутилоксикарбонил-L-лизил — глицил-L - глутаминтрет.-бутиловый эфир.

К 31,9 r хлоргидрата 1 -аспарагинил-Квтрет.-бутилоксикароонил - L - лизил — глицил1 -глi тамии — трет.-бутилового эфира (по п. E) и 33,68 г Ка,КЬ,Ко-трибензилоксикарбонилI -аргинин-К-оксисукцинимидного эфира в

1 л диметилформамида добавляют при 0 С

7 мл триэтиламина и перемешивают 24 ч при

0 С, а затем при комнатной температуре; далее проводят упаривание в вакууме, переосаждение остатка из метанола/воды и затем перекристаллизация из метанола дают бесцветный порошок; (а) = — 7,6 (с 1,0; ледяная уксусная кислота). Выход 46,5 г (80% от теории).

3. Дибромгидрат L-аргинил (бромгидрат)1 -аспарагинил-Кв-трет. — бутилоксикарбонил1 -лизил-глицил — I — глутамин — трет.-бутилолого эфира.

45,5 г Na,NÜ,Ко-трибензилоксикарбонил-lаргинил - 1.- аспарагпнил -Кв-трет. - бутилоксикарбонил-I -лизил - глицил - I - глут5

Зо

55 б0 б5 амин-трет.-бутилового эфира (по п. Ж) в

1,5 л диметилформамида/метанола (2: 1) деацилируют гидрогенолизом при статических условиях величины рН (рН=4.5; 80 мл 1 н. оромистоводородной кислоты). Упаривание фильтрата в вакууме и переосаждение остатка из этанола/диэтилового эфира дает аморфный порошок; (а) — 4,8 (с 1,0; 80%ная уксусная кислота) . Выход 37 r (98% от теории). Выход 55%/в пересчете на исходный (22 в)/; (а) o — 7,6+1 (с 1,0; уксусная кислота) .

Продукт хроматографически однороден в н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3: 1: 1 и и-гептане/трет.-бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 5: 1: 1, Вычислено, %: С 57,98; Н 6,69; N 13,29;

О 22,02.

Найдено, %: С 57,70; Н 6,56; N 13,29; О

22.45.

После удаления трех бензилоксикарбонильных защит катал итическим гидрогенолизом в присутствии двух эквивалентов бромистого водорода получают требуемую фракцию 1 (18 — 22в) . Выход 98%; (а1 а = — 4,8 1 (с 1, 80%-ная уксусная кислота); хроматографически однородная B и-бутаноле/ледяной уксусной кислоте воде, 3: 1: 1 и тпетичном амиловом спирте/пиридине/воде, 35: 35: 30.

Вычислено, %: С 40 21; Н 6 85; N 16 12;

Вг 16,72.

Найдено, %: С 40,46; Н 6,93; К 15,89;

Br 16,51.

Пример 2. Получение фрагмента (аминокислоты 14 — 17).

Z — Lys — (В ОС) — Osu (16) и Н вЂ” Glu (OtBu) — ОМе(17} соединяют обычным способом в (16 — 17а); щелочное омыление и последующее каталитическое деацилирование приводят к получению Н вЂ” Lys (ВОС) — Glu— (OtBu) — ОН (16 — 17с) . Присоединенисх

7 — Glu (OtBu) — OSu (14 илп 15) получают фрагмент II, а именно Z — Glu (OtBu) — Glu (OtBu) Lys (ВОС) — Glu (OtBu) — ОН (14—

I7a) .

Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1.

Выход 48% (в пересчете на исходный

Н â€” Glu (OtBu) — OÌå (17); (а) î = — 9 81-1 (с 1, диметилформамид); т. пл. 147 — 149 С.

Продукт хроматографически однороден в циклогексане/хлороформе/ледяной уксусной кислоте, 45: 45: 10.

Вычислено, %: С 59,02; Н 7,86; N 7,48.

Найдено, %: С 58.70; Н 8,04: N 7,72.

Пример 3. Получение фрагмента III (аминокислоты 12 — 13) осуществляют аминоацилированием норлейцина (13) Z — Arg (6.(в — Z>) — OSu (12). Выход 86%.

Эксперимент проводят аналогично примеру 1, т. пл. 130 — 132 С; (а) =+7,2+11 (с 1, ледяная уксусная кислота).

Продукт хроматографически однороден в игептане/третичном бутаноле/ледяной уксус562193

7 ной кислоте, 5: 5: 1; и н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде 3: 1: 1.

Вычислено, о/о. С 62,69; Н 6,28; N 10,15.

Найдено, о/о. С 62,45; Н 6,28; N 10,16.

Пример 4. Получение фрагмента IV (аминокислоты 9 — 11) . Синтезированный:ro известному способу дипептид Н вЂ” Leu — Gln—

ОН (10 — 11) связывают с Z — Glu (OtBu)—

OSu (9) и получают Z — Glu (OtBu) — Leu—

Gln — ОН (9 — 11); выход 74О/о.

Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1, т. пл. 146 — 148 С; (а) о

= — 31,611-1 (с 1, метанол).

Продукт хроматографически однородный в н-гептане/третичном бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 5: 1: 1 и и-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3: 1: 1.

Вычислено, /о. С 58,12; Н 7,82; N 9,68.

Найдено, /р. С 58,05; Н 7,84; N 9,48.

Пример 5. Получение фрагмента V (аминокислоты б — 8).

Синтезированный по известному способу дипептид Н-Tyr (tBu) — Gly — ОН (7 — 8) соединяют с Z — Thr (tBu) — OSu (б), получают защищенный трипептид (6 — 8а), который дибензилоксикарбонилированием превращают в требуемый фрагмент Ч, а именно, Н вЂ” Thr (tBu) — Туг (tBu) — Gly — ОН (б — 8в).

Эксперимент осуш" ствляют аналогично примеру 1.

Выход около 81 /о (в пересчете на исходный дипептид 7 — 8); т. пл. 126 — 127 С; (а) =+7,91-1 (с 1, метанол), Продукт хроматографически однороден в третичном амиловом спирте/пиридине/воде, 35: 35:30, Вычислено, о/о. С 60,88; Н 8,30; N 8,88.

Найдено, /о. С 60,69; Н 8,31; N 8,91.

Расчеты даны в пересчете на дипептид с

1/4 мол. кристаллизационного этилацетата.

Пример б. Получение фрагмента VI (аминокислоты 1 — 5).

По указанному способу с карбодиимидом

Z — Ле — ОН (4) соединяют с Н вЂ” Phe — OtBu (5). После каталитического деацилирования промежуточного защищенного дипептида выделяют Н вЂ” Ле — Phe — OtBu (4 — 5в).

Выход 90 /О.

ВОС вЂ” Val — ОН (2а) и Н вЂ” Pro — ОМе (За) по указанному фосфоразо-методу соединяют в защищенный дипептид (2 — Ça); последующее омыление дает ВОС вЂ” Val — Pro — ОН (2 — Зв).

Выход 70 /о. Дипептид (2 — Зв) получают еще реакцией ВОС вЂ” Val — OSu (2в) с двумя эквивалентами пролина (Зв). Выход 83 /о.

Оба производных дипептидов карбодиимидным методом соединяют в ВОС вЂ” Val—

Pro — Ле — Phe — OtBu (2 — 5а); обработка трифторуксусной кислотой (2 — 5a) дает свободный тетр апептид Н вЂ” 3 al — Pro — ЛевЂ

Phe — ОН (2 — 5в), к которому присоединяют

ВОС вЂ” Phe — OSu (I) и получают BOC — Phe— — Val — Pr0- — Ле — Phe — ОН (1 — 5а) (фрагмент VI), 5

Эксперимент осуществляют аналогично примеру 1.

Выход 63% /в пересчете на (4 — 5в)/; т. пл.

218 С; (а)" — 64,2+ -1 (с 1, уксусная кислота) .

Продукт хроматографически однороден в я-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3: 1: 1 и третичном амиловом спирте/пиридипе/воде, 35: 35: 30.

Вычислено, /о. С 64,88; Н 7,64; N 9,70.

Найдено, о/о. С 64,72; Н 7,70; N 9,61.

П р и м ер 7. Конденсация фрагментов

1 — VI (общая последовательность 1 — 22).

Фрагмент II (14 — 17a) при помощи указанного способа с дициклогексилкарбодиимид-Nоксисукцинимидом соединяют с фрагментом I (18 — 22в), получают защищенный нонапептид (14 — 22а), который каталитическим гидрогенолизом переводят в Н вЂ” Glu (OtBu)—

Glu — (OtBu) — Lys (BOC — Glu (OtBu) — Ar g (HBr) — Asn — Lys (ВОС) — Gly — Gln — OtBu (14 — 228). Присоединение фрагмента III к (14 — 22в) осуществляют тем же способом и получают Z — Arg (б,а — Z ) — Nle — Glu (OtBu)

Glu (OtBu) — Lys (ВОС) — Glu (OtBu) — Arg (HBr) — Asn — Lys (ВОС) — Gly — Gln — OtBu (12 — 22а) Выход около 69 /о (в пересчете на исходный фрагмент I); (а) "= — 4,9+1 (с 0,7; метанол) .

Продукт хроматографически однородный в и-бутаноле /ледяной уксусной кислоте/воде, 3; 1: 1 и и-гептане/третичном бутаноле/ледяной уксусной кислоте, 3: 2: 1.

Вычислено, /р. С 55,48; Н 7,29, N 12,82; О

20,92; Вг 3,48.

Найдено, /о. С 55,24; Н 7,27; N 12,62; О

20,97; Br 3,20.

Каталитическим гидрогенолизом в присутствии бромистого водорода производного ундекапептида (12 — 22a) удаляют бензилоксикароонильные защитные группы и получают в виде бромгидрата Н вЂ” Arg (HBr) —.Nle—

Glu (OtBu) — Glu (OtBu) — Lys (ВОС) — Glu (OtBu) — Arg (HBr) — Asn — Lys (ВОС)—

Gly — Gln — OtBu (12 — 22в), Конденсацию фрагмента IV (9 — 11) с (12—

22в) проводят по указанному способу с дициклогексилкарбодиимид - N — оксибензтриазолом. После отщепления гидрогенолизом Zзащитной группы выделяют в чистом виде

Н вЂ” Glu (OtBu) — Leu — Gln — Arg (HBr)—

Nle — Glu (OtBu) — Glu (OtBu) — I ys (ВОС)—

G1u (OtBu) — Arg (HBr) — Asn — Lys (ВОС)—

Gly — Gln — OtBu (9 — 22в) . Выход 77 О/О. (a) DO = — 6,3 1 l (с 0,7, метанол).

Продукт хроматографически однороден в н-бутаноле/ледяной уксусной кислоте/воде, 3: 1: 1.

Вычислено, /о. С 47,99; Н 7,58; N 13,72 .

Найдено, /о. .С 47,81; Н 7,28; N 13,69.

Аминокислотный анализ: I уз 1,99; Arg

1 98; Asp 1,03; Glu 6,30; Gly 0,98; Ееп 0,97;

Nle 1,01, 562193

Фрагмент V (6 — 8а) соединяют с N-оксисукцинимидным эфиром фрагмента VI (l—

5в). Однако нс удается получить соеинение (1 — 8) в чистом виде, а именно ВОС вЂ” Phe—

Val — Pro — Jle — Phe — Thr (tBu) — Туг (tBu)—

Gly — ОН. Аминокислотный анализ октапептида (1 — 8) показывает, что он загрязнен — 10% (1 — 5а или в); попытки разделения этой смеси безуспешны. Поэтому «сырой» фрагмент (1 — 8) соединяют с производным тетрадекапептида (9 — 22в) вышеуказанным способом в ВОС вЂ” Phe — Val — Pro — Jle — Phe—

Thr (tBu) — Туг (tBu) — Gly — Glu (OtBu)—

Leu — Gln — Arg (HBr) — Nle — Glu (OtBu)—

G!u (OtBu) — Lys (ВОС) — Glu (OtBu) — Arg (H Br) — Asu — Lys (В ОС) — G1 y — G 1 n — Ot B u (1 — 22a) . После отщепления всех защитных групп действием безводной трифторуксусной кислоты и последующего отделения ионов трифторацетата и бромида ионообменной хроматографией на слабоосновной (в ацетатной форме) смоле «Дауэкс 44», получают

«сырой» L-норлейцин-13-мотилин (1 — 22в), который загрязнен введением «нечистого» фрагмента (1 — 8).

Экспериментальное осуществление конденсации фрагментов.

А. Конденсация 1 с И.

9,2 г фрагмента 1 (по примеру 1), 9,36 г фрагмента II (по примеру 2) и 1,4 мл триэтиламина в 200 мл диметилформамида смешивают при 0 С с 2,3 r N-оксисукцпнимида и затем с 3,1 г N,N -дициклогексилкарбодиимида, Реакционную смесь перемешивают 24 ч при

5 С и 4 дня при комнатной температуре, фильтрат упаривают в вакууме. Остаток несколько раз отмывают водой и дважды переосаждают из метанола/этилацетата. Получают трет.-бутиловый эфир защищенного нонапептида в виде аморфного порошка. (а)", =

= — 14,6 (с 1,0; диметилформамид). Выход

14,8 г (84% от теории).

12,3 г полученного соединения в 800 мл метанола каталитически гидрируют при статических условиях величины рН (рН=5,5; 7 мл

1 н. бромистоводородной кислоты). Фильтрат упаривают в вакууме, остаток дважды переосаждают из этанола/этилацетата. Получают бромгидрат трет.-бутилового эфира Lглутамил (y-трет.-бутиловый эфир)-L - глутамил (у-трет.-бутиловый эфир) -Ne-трет.-бутилоксикарбонил - 1 - лизил - I - глутамил, (y-трет.-бутиловый эфир) - I - аргинил(бромгидрат) — I — аспарагинил-Ne, - трет.бутилоксикарбонил-I — лизил - глицил — тлутамина. (а) = — 21,5 (с 1,0; метанол). Выход 11,4 г (96% от теории).

Б. Конденсация (1 — II) с III.

3,4 r производного нонапептида (по п. А), 2,8 г фрагмента II (по примеру 3) в 200 мл диметилформамида и 0,70 г N-оксисукцинимида смешивают при — 10" С с 0,28 мл триэтиламина и затем с 0,.825 г U,N -дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают и

53

24 ч при +4 С и 24 ч при комнатной температуре. После удаления растворителя в вакууме остаток персосаждают из метанола/

/этилацетата, затем промывают водой и еще раз переосаждают из метанола/этилацетата.

Получают защищенный ундекапептид в виде аморфного порошка. (а) = — 4,9 (с 0,7; метанол). Выход 3,9 г (85,,, от теории).

3,5 г полученного производного ундекапептида в 800 мл метанола каталитически гидрируют при статических условиях величины рН (pH=4,5; 31 мл 0,2 н. раствора бромистого водорода в метаноле). Остаток из упаренного в вакууме фпльтрата переосаждают из метано IB/ýòuëàïåòàòà. Получают бромгидрат трет.-oyTHëoâoro эфира I -аргинил-1 -норлейпил-I -глутамил (у-трет. - бутиловый эфир)I -глутамил (у-трет.-бутпловый эфир) - Ncтрет.-бутилокспкарбонил - 1 - лизпл-1 -глутамил (у-трет.-бутпловый эфир) - 1 — аргинилl -аспарагинил-Ue-трет. - бутилоксикарбонилI -лизил-глипил-глутамина в виде порошка. (а) о = — 21,7 (с 1,0; метанол). Выход 3,0 г (95% .от теории) .

В. Конденсация (I — II — III) с IV.

2,7 г производного ундекапептида (по п. Б).

1,5 г фрагмента IV (по примеру 4) и 0,405 г

1-оксибензтриазола в 200 мл диметилформамида смешивают при 0 С с 0,182 мл триэтиламина и затем с 0,577 г N,ЬГ-дициклогексилкароодпимида. Реакционную смесь перемешивают 24 ч при 0 — 5 С и затем еще 5 дней при

25 C. Остаток после упаривания в вакууме переосаждают дважды из метанола/этилацетата, после высушивания B вакууме промывают водой и затем еще раз переосаждают из метанола/диэтилового эфира. Получают защищенный тетрадекапептид (1 — I I — III — IV) в виде аморфного порошка. (а)„= — 4,3 (с 0,7; метанол). Выход 2,7 г (82% от теории).

2,0 г полученного производного тетрадекапептида в 800 мл метанола каталитически гидрируют при постоянном значении рН (рН 4,5; 8 мл 0,1 н. бромистоводородной кислоты). Остаток после упаривания фильтрата переосаждают из метанола/этилацетата.

Получают тетрабромгидрат трет.-бутилового эфира I -глутамил (у-трет.-бутиловый эфир) -1 -лейцил-I -глутамил — I - аргинил-1— норлейцил-I -глутамил (у - трет.-бутиловый эфир) -1 -глутамил (y-трет. - бутиловый эфир)Ne-трет.-бутилоксикарбонил - 1 - лизил глутамил (у-трет.-бутиловый эфир) - I - аргинил-1 -аспарагинил-Ne-трет. — бутилоксикарбонил-1-лизил-глицил - 1 - глутамина в виде аморфного порошка. (а) = — 6,3 (с 0,7; метанол) . Выход 1,82 г (94% от теории) .

Г. Конденсация V c VI.

21,6 г фрагмента VI и 6,9 г N-оксисукцинимида в 400 мл диметилформамида смешивают при — 5 С с 6,3 г N,1N 1 -дициклогексилкарбодиимида, реакционную смесь перемешивают

2 ч при 0 С и в течение 10 — 15 ч при комнатной температуре. Фильтрат упаривают в ва562193

Таблица 1

Фракция

Вычисленное отношение для

L-норлейцин-13-мотилина в

2,04

1,99

1,01

6,00

0,91

1,06

0,88

0,86

0,99

1,00

1,73 кууме. Маслянистый остаток кристаллизуют из изопропанола. Получают трет.-бутилоксикар бонил-I -фенилаланил — I -валил-I -пролил1-изолейцил-1 — фенилаланин - N - оксисукцинимидный эфир, т. пл. 190 — 192 С; (а) „

+59,28 (с 1,0; диоксан). Выход 21,3 r (88% от теории).

12,2 г фрагмента V и 3,8 мл триэтиламина в 400 мл диметилформамида смешивают с

14,8 r полученного N-оксисукцинимидного эфира, реакционную смесь после перемешивания в течение 24 ч при комнатной температуре упаривают,в вакууме, маслянистый остаток растворяют в этилацетате и растворе лимонной кислоты. Этилацетатный слой промывают, как обычно, сушат н упаривают в вакууме досуха. Из этилацетата/петролейного эфира получают бесцветные кристаллы трет.бутилоксикарбонил-I — фенилаланил-L-валилL-пролил-L-изолейцил - L - фенилаланил-0трет.-бутил-I - треонил-0-трет. — бутил - Lтирозил-глицина. (к) ра — — 44,0 (с 1, этанол). Выход 18,2 r (87% от теории).

Д. Конденсация (I — II — III — IV) с (V — VI).

1,3 г производного тетрадекапептида (по и. В), 1,17 г защищенного октапептида (по п. Г), 0,07 мл триэтиламина и 0,175 г iN-оксисукцинимида (или 0,20 г оксибензтриазола) в

100 мл диметилформамида смешивают при (— 10 С) с 0,257 г iN,N -дициклогексилкарбодиимида. Смесь перемешивают 2 дня при 0 С и 3 дня при комнатной температуре. После удаления растворителя в вакууме остаток тщательно растирают с горячим этилацетатом, смолистый продукт переосаждают из метанола/этилацетата, сушат после растирания с этилацетатом и затем 5 ч тщательно обрабатывают,водой. После переосаждения из метанола/воды получают аморфный порошок (1,1 r) защищенного докозапептида (I — II—

I П вЂ” ГЧ вЂ” V — VI) .

0,2 r полученного продукта заливают 20 мл ледяной трифторуксусной кислоты и выдерживают 2 ч при комнатной температуре. Избыток трифторуксусной кислоты удаляют в вакууме по возможности при низкой температуре, остаток растворяют в разбавленной уксусной кислоте, полученный раствор дважды обрабатывают 4 г слабоосновной анионообменной смолы в ОН вЂ” форме, после чего элюат подвергают лиофилизации. Выход

157 чг

Пример 8. Получение синтетического продукта в чистом, виде.

А. Проводят ионообменную хроматографию 25 мг полученного сырого I -норлейцин13-мотилина на существующей в ацетатной форме, сильноосновной анионообменной смоле «QAE-Сефадекс А-25».

Экспериментальные условия: колонна 30;к,0,9 см; 25 мг продукта, растворенного в 2 мл 0,5%-ного аммиака;

12 система: 0,025 М раствор ацетата аммония (доведенного разбавленным аммиаком до рН=9,27). скорость потока 18 мл/ч; фракции по 6 мл.

Производят разделение на две основные фракции Bi и В .

Фракция В (около 4 мг) является ожидаемой неправильной последовательностью (1—

5/9 — 22), фракция В> (около 12 мг) является искомым L-норлейцин-13-мотилином. Полученный сушкой,вымораживанием в твердой фазе докозапептид оказывается однородным в системе: н-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода/пиридин, 30: 6: 24: 20 и н-бутанол/ледяная уксусная кислота/вода/пиридин, 30: 12:

: 24: 20, как при хроматографии на бумаге, так и при тонкослойном хроматографировании.

Аминокислотный анализ фракций В и В проводят после кислотного гидролиза (6 н.

НС1, 20 ч), причем оказывается, что при гидролизе в течение 72 ч получают практически одинаковые величины (табл. 1).

1,98

1,98

1,00

1,00

6,08

0,97

1,99

0,94

0,95

1,00

1,01

0,91

1,82

Биологическая активность высу шенной вымораживанием фракции Bi 50 /о. Опыты по фер ментативному гидролизу подтверждают предложенную первичную структуру.

Б. Указанную в п. A методику очистки повторяют с применением следующих экспериментальных условий: колонна 80;к, 1,5 см;

235 мг сырого продукта, растворенного в

15 мл 0,5 -ного аммиака, подают на уравновешенную 0,025 М раствором ацетата аммония (доведенного разбавленным аммиаком до р Н = 9,20) колонну; растворитель: 0,025 М раствор ацетата аммония (рН 9,20); скорость потока: 47 мл/ч; фракции по

23,5 мл, распределение пептида определяют измерением экстинкции при 220 нм.

562193

Таблица 2

15

Формула изобретения

25 Способ получения 1.-норлейцпн-13-мотилина общей формулы

Н вЂ” Phe-Va1 — Рго — 31е-Phe Thr — Тт)г — Ят1 — Clu Xeu — С 1гт (1) (2) (3) (й) (5) (6) (7) (8) (9? (10) (11) Arg — N1e — G1u — Иu — „«ерем-G1u — Ащ Asn Xgs-Нт -61гт — 011 (12) (13) (1Ч) (15) (16) (17) (15) (19) (20) (21) (22) глутампл ($ -трет.-бутиловый эфир) - лейцилглутамин (аминокислоты 9 — 11), фрагмент V — О-трет.-бутпл-треонпл-О-трет.бутил-тирозил-глицпн (ампнокислоты 6 — 8), 30 фрагмент VI — Nc -трет.-бутилоксикарбонил-фенилаланил - валил-пролил - изолейцил-фенилаланин (аминокислоты 1 — 5); синтезированные фрагменты I — VI конденсируют друг с другом известным способом, 35 например, модифицированным карбодиимидным, на основе дициклогексилкарбодиимид-Nоксисукцинимида; с полученного производного полип ептида (1 — 22) удаляют защитные группы действием трифторуксусной кислоты с

40 последующим выделением целевого продукта известным способом.

Составитель Л. Волкова

Техред И. Позняковская

Редактор Т. Девятко

Корректор Л. Брахнина

Заказ 2798/11 Изд. ¹ 520 Тираж 650 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, К-35, Раушская паб., д. 4/5

Типография, Ilp. Сапунова, 2

13

Осуществляют разделение на две фракции

BI (135 мг) и В (44 мг), весовые данные относятся к подвергнутым лиофилизации фракциям.

В. Для дальнейшей очистки,135 мг фракции

В1 обрабатывают хроматографией на колонне на существующей в аммонийной форме сильнокислой катионообменной смоле «ЯР-Сефадекс С-25».

Экспериментальные условия следующие: колонна 80+1,5 см; растворитель: 10 мл

0,5% -ная уксусная кислота; система: 1—

0,025 М раствор ацетата аммония, полученный из 0,025 М уксусной кислоты добавлением разбавленного раствора аммиака до рН 5,0;

2 — 0,025 М раствор ацетата аммония (рН

=5,38); скорость потока; 110 мл/ч; фракции по 37 мл.

Получают две основные фракции, а именно

CI (57 мг) и Сз (48 мг). ,Фракция С2 биологически неактивна, фракция С1 показывает биологическую активность выше 90% по сравнению с природным мотил ином.

Результаты проведенных аминокислотных анализов приводятся в табл. 2. отличающийся тем, что получают отдельные защищенные фрагменты: фрагмент 1-аргинил- (бромтидрат) — аспарагинил-Ne,- трет. - бутилоксикарбонил - лизилглицил-глутамин - трет.-бутиловый эфир (аминокислоты 18 — 22), фрагмент I I — Nn-бензилоксикарбонилглутамил- (у-трет.-бутиловый эфир) -глутамил(у-трет.-бутиловый эфир) -Ив-трет.-бутилоксикарбонил-лизил-глутаминовая кислота (утрет. - бутиловый эфир (амиHoêèñëoòû 14—

17), фрагмент III — Nn, N6, NoI-три(бензилоксикарбонил) - аргинил - норлейцин (аминокислоты 12 — 13), фрагмент IV — No:-бензилоксикарбонил1,99

2,03

1,00

1,00

6,08

0,99

2,02

0,95

0,95

1,00

0,99

0,91

1,92

1,98

1,96

1,03

1,00

6,14

1,05

2,08

0,91

0,90

1,00

1,00

1,91

1,91