Способ получения иммобилизованной аминоацилазы

 

OllH(:AHHE

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4::аюа Советсиии

СИ1)йаяийтичзсииы

Республик (<>) 5 /5352 (6l) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 0601.76 (21) 231.0887/23-04 (51) М. Кл. с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано051077. Б1оллетень № 37 (45) Дата опубликования описания 2610.77

С 07 (7/02//

/А 61 К 37/4 е

AayapaTaaaavl ееаетет еееете NaaacTpoa CQGP ее aaaaal ееебретееее

% OTapblTall (53) УДК 577. 15. 07 (088. 8) (72) Авторы изобретения

И.Г.Страэдннь, И.П.Розиня, В.Э.Калис и A.Ê.Àðåí

Щ Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ

АМИНОАЦИЛАЗЫ .

Изобретение относится к получению нерастворимых ферментных препаратов, а именно к способу получения иммобилизованной аминоацилазы, используемой в качестве гетерогенного катализатора для ассиметрического гидролиэа рацемической смеси H -ацил-D,L -аминокислот.

Известен ряд способов получения им мобилизованной аминоацилазы на органических носителях, например на бром- 10 ацетилцеллюлозе или на ДЭАЭ- сефадексе.

Однако низкая химическая и микроби ологическая стойкость, плохие механи* ческие и гидродинамические свойства ограничивают использование в промыш- 15 ленности этих производных.

Известен также способ получения им- мобилиэованной аминоацилаэы на неорганическом носителе — силохроме путеМ адсорбирования на силохроме ацилаэной 20 активности иэ экстракта ацетонового порошка свиных почек.

Полученную иммобилиэованную аминоацилаэу используют многократно (до пяти раз) для асимметрического гидроли" 25 за 0,5 М растворов )4 -ацетил-)), Ь -аминокислот, K недостаткам этого простого способа относятся неэкономичное использование ацилазного сырья (выход ацилаз 80

Йой активности составляет только 10% от ацилазной активности использованного на иммобилиэацию экстракта ацетонового порошка свиных почек) и получение иммобилизованной аминоацилазы с относительно низкой ферментативной устойчивостью, что ограничивает ее использование (примерно пять раз и не более, чем в 0,5 М растворах субстратов) .

Цель изобретения — повышение стабильности целевого продукта и упроще» ние процесса — достигается тем, что неорганический носитель, например силохром или.силйкагель, последовательно активируют силанизирующим агентом, предпочтительно т-аминопропилтриэтоксисиланом, и производным дихлор-симмтриазина, таким, как активный краситель, например ярко-голубой КХ, и аминоацилазу ковалентно связывают на носителе в присутствии К-ациламинокислоты, преимущественно рацемической М-ацетиламинокислоты, например D, Ь -аце тилаланина.

После активирования силохрома е -аммнопропилтриэтоксисиланом на вго поверхности находятся реакционноспособныв аминогруппы, которые через производное

575352

Формула изобретения

Составитель A.Áî÷àðoâ

Техред С. Беца Корректор A.Êðàâ÷åíêî

Редактор T.Øàðãàíîâà

3988/18 Тираж 553 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений н открытий

113035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Эакаэ филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 дихлор-симм-триаэина ковалентно присоединяют аминоацилаэу.

Й -Ацетиламинокислота (субстрат) защищает реакцнонноспособные группы активного центра амнноацилазы от нежелательной модификации при связывании аминоацилазы с носителем, Наличие ковалентной связи между аминоацилазой и неорганическим носителем способствует увеличению ферментативной устойчивости иммобилизованной 10 аминоацилазы, в результате чего ее можно использвать в любых, s то числе и в более концентрированных (например

1М) растворах исходных N--ацил-O,L-аминокислот, при том не менее десяти раэ..)6

При получении иммобилиэованной амииоацилазы предлагаемым способом полнее используется ацилазное сырье (выход ацклаэной активности составляет

50% от ацилазной активности испольэу- 39 емого на ньеюбнлнзацию экстракта ацетонового порошка свиных почек.).

Предпочтительно процесс проводят следующим образом.

Склохром или силккагель активируют 1р сначала т -амкнопропклтриэтокснсиланом в абсолютном этаноле при температуре кипения в течение 30 час, а затем раствором активного красителя яркоголубого KX или ярко-оранжевого в ди- р метилформамиде (ДМФА) при комнатной температуре в течение 12 час.

Полученный носктель суспендируют в растворе, который состоит иэ экстракта ацетонового порошка евиных почек З(к с ацилазной активностью и К -ацетиламкиокислоты, выдерживают 10 мнн при комнаткой температуре, отфильтровывают, промывают раствором хлористого натрия и хранят полученный катализатор под раствором й-ацетиламинокислоты при 4 90

Пример. 20r силохрома С-80 (фракция

0,1 - 0,16 мм), 6 мл т -аминопропилтриэтоксксклана и 200 мп абсолютного этаиола кипятят 30 час при перемешивании, отфильтровывают, промывают 1 л абсолютного этанола, сушат сначала.12 чае, иа воздухе и затем 1 час над пятиокисью фосфора в вакууме (5 мм рт.ст.) при 180 - 190 С.

Количество аминогрупп 600к кМ/r носителя.

4 г силаниэированного силохрома смешивают с раствором 0,15 r активного красителя ярко-голубого КХ в 60 ми

ДМФА, выдерживают 12 час при комнатной температуре, отфильтровывают, проьывают ДМФА и сушат в вакуум-эксикаторе.

K 1 г активированного носителя прибавляют 1 мл экстракта ацетонового порошка свиных почек в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,2) с общей ацилазной активностью 2000 р кМ/час Ь -аланина и

4 мл lN M -ацетил-8, 4 -аланина, выдерживают 10 мнн прн комнатной температу» ре. Иммобклиэованную аминоацилазу от-, фильтровывают, промывают дважды 20 мл

1М раствора хлористого натрия, 20 мл

0,1 М фосфатного буфера (рН 7,2).

Получают катализатор с общей актив+ ностью 1000)ц кМ/час Ь -аламина.

Полученную иьвюбилиэованную амино ацилаэу хранят в растворе М-ацетилаланина.

1.Способ получения иммобклизованной аминоацилазы посредством связывания ее с неорганическим носителем, напри- мер силохромом или силикагелем, о тл и,ч а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности целевого продукта и упрощения, процесса, носитель предварительно подвергают последовательной активации силанизирующим агентом и производным дихлор-синее-триаэина, а аминоацилаэу ковалентно связывают на носителе в прксутствнк М-ациламинокислоты.

2.Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве силанк» эирующего агента используют y - -аминопропилтриэтоксисилан.

З.Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аю шийся тем, что в качестве производного дихлор-сими-триаэина используют активный краситель, например яр» ко-гоЛубой КХ.

4.Способ по пп. 1-3, о т л и ч а ю. шийся тем, что в качестве И -ацетиламинокислоты используют рацемичес- кую Х -ацетиламинокислоту, например

О,(--ацетилаланин °