Способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях

 

Союз Соевтсинк

Социал нстнчесинк

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ()934380 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22)Заявлено 04.08.80 (21) 2995519/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет (51)М. Кл.

G 01 N 33/48

ГоеуяаретеекыФ кемнтет ссер во делен. изе4ретекий и открытий (53) УДК612.13 (088. 8) Опубликовано 07.06.82 ° е«юллетень _#_e 21

Дата опубликования описания 07.06.82

А.П. Бресткин, Е.Б. Никольская, А.М. ПисЬрев и Н.Б. Шор

It т,» ъ1; (72) Авторы изобретения

Институт эволюционной физиологии и био сими им. И.M. Сеченова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ

Изобретение относится к биохи мии и касается определения актив,ности ферментов.

Известен способ определения активности холинэстеразы в биологических жидкостях путем измерения скорости изменения потенциала окислительновосстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстрата 1), Однако известный способ обладает то недостаточно высокой чувствительностью (0,5-0,005 е/мл).

Цель изобретения - увеличение чувствительности способа.

Указанная цель достигается тем, что способ определения активности . холинэстеразы в биологических жидкостях осуществляют путем измерения скорости изменения потенциала окислительно-восстановительного электрода,-помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстрата, электрод предварительно

2 уравновешивают в 10 -10 " M растворе ферро-.феррицианида калия или в 10 -1О М водного раствора йода.

На фиг.1 приведены кривые зависимости потенциала от времени гидролиза ацетилтиохолин бромида при различных активностях холинэстеразы сыворотки крови лошади (электрод

ЭО-1 предварительно уравновешен в

О, 1 И раствора ферро-феррицианида калия, активность фермейта на кривых 1-6 соответственно равна 10;

10,1; 0,01; 0,001 и 0,00012 е/мл, на кривой 7 представлен спонтанный гидролиз); на фиг. 2 — кривые зависимости потенциала от времени гидролиза ацетилтиохолин бромида при различных активностях холинэстеразы сыворотки крови лошади (электрод

ЭО-1 предварительно уравновешен в

5 -10 M растворе I, активность фермента на кривых 1-6 соответственно равна 10; 1; 0,1; 0,01; 0,001

93438

3 и 0,0001 е/мл, на кривой 7 представлен спонтанный гидролиз) .

Пример 1. В термостатируемую кювету обьемом 2 мл наливают 1,0 мл раствора фермента бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,4 - 8,0 с активностью от 20 до 2 ° 10 4 е/мл..Электрод ЭО-1 предварительно уравновеши вают в 0,1 И растворе ферро-ферри- !О цианидов, затем промывают 3-4 раза водой и помещают в исследуемую реакI, ционную смесь. Электродом сравнения служит хлорсеребрянь|й электрод в насыщенном растворе хлористого калия 1S (ЭВЛ-1М-3), Электроды подключают.к рН-метру рН-121 или рН-340. Потейциал системы всегда составляет

236 м8. Затем добавляют 1 мл 2. 10 М ацетилтиахолин бромида и измеряют скорость падения потенциала в диапазоне 200-100 мВ (фиг.l). После окон.чания измерений электрод промывают несколько раз водой, помещают на несколько минут в раствор ферриферроцианидов, после чего он снова готов к работе.

Пример 2. В термостатированную кювету объемом 2 мл наливают

1,0 мл раствора фермента бутирилхолинэстеразы сыворотки крови лошади на 0,1 И фосфатном буфере рН 7,48,0 с активностью от 20 до 2.10 е/мл и 0,01 мл свежеприготовленного водного раствора Х (5 10 М) ..В раствор эз помещают индикаторный электрод ЭО-1 и хлорсеребряный электрод сравнения. формула изобретения

Способ определения активности холинэстеразы в биологических жид."костях путем измерения скорости изменения потенциала окислительно-восстановительного электрода, помещенного в испытуемую биологическую жидкость с добавлением субстрата, о т л и ч а ю щ и " с я тем, что, с целью увеличения чувствительности способа, электрод предварительно уравновешивают в 10 - 10 И растворе ферро-феррицианида калия или в

10- 5 - lo- 4 И водного раствора йода.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Kramer 13.М., Cannon P.L. and

GuiIbauIt G.G; EIectrochemicaI

determination of choIinrsterase апд МпосЬоЫпе esters. "AnaIyticaI

chemistry", 19á2, 34, h" 7, р. 8428И.

0 4

Устанав1ивают потенциал 412 мВ. 3атем в реакционную смесь вносят

1 мл 2 10 М ацетилтиохолинбромида и измеряют скорость падения потенциала от 400 до 300 мВ (фиг.2).

После опыта электрод промывают также, как указано в примере 1.

Предлагаемый способ позволяет увеличить чувствительность до

1,2 ° 10 е/мл и диапазон измерения активности холинэстеразы (10

10 4 е/мл).