Перхлораты пиримидо [1,2-а] бензимидазолия в качестве флуоресцентных красителей растительных тканей и микроорганизмов

 

Перхлораты пиримидо U 2-q бензим11дазапия общей формулы % 8% где 1а 16 R,.H; R.a R - СоН, 8 17 IB : R , ОСН. 1г R .1 , R -Н ; ОСИ |Д J. в качестве флусфесцентных красителей растительный тканей и микроорО ганизмов. :л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

-.) "i

С> Н„, RÄ-Н; с8 н,р

°, (:9H(9,,R< 01:

С„аНд, Ä RÄ =81

С(ОН 4 е где 1а: R

1б: R

H), Н

1г: к

Iд ::R . в качестве флуоресцентных лей растительный тканей и ганизмов. краситемикроор. Ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫПФ (21) 3462494/23-04 (22) 01.07.82 (46)30.10.83. Бюл. Р 40 .(72) H.A.. Дмитриева, С.Г. Благородов, Л.Н. Чернавская, Э.A. Звездина и М.П. Жданова (71) Ростовский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. M.A. Суслова и

Ростовский-на-Дону научно-исследовательский институт эпидемиологии, . микробиология и гигиены. (53) 547.785.5(088.8) (56) 1. Зеленин A.Â. Взаимодействие аминопроизводных акридина с клеткой.

М., 1971 с. 7-70.

2. Зубжицкий 10.H. Метод люминесцентной микроскопии и микробиологии, вирусологии и иммунологии. Л., 1964, с. 44-49.

3. Лилля P. Патогистологическая техника и практическая гистология.

М., 1969, с. 104-538. ! (54) ПЕРХЛОРАТЫ ПИРИМИДО (1,2-tl) БЕНЗИМИДАЗОЛИЯ В КАЧЕСТВЕ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ КРАСИТЕЛЕЙ РАСТИТЕЛ1НЫХ ТКАНЕЙ

И МИКРООРГАНИЗМОВ.

Зи11 С 07 0 487/04 A 61 К 31 505 (57) Перхлораты пиримидо (1,2- ц3 бензимидазолия общей формулы

1051091

Изобретение относится к новым производным солей пиримидо (1,2-а) бенэимидаэолия, а именно к перхлоратам пиримидо-(1,2-а) бенэимидазолия общей формулы

Ю б (I)

N 10

,н, !

=Н

7 где Ia К Схн1т к с н

: R- С,Н„

: R- С1ОН11 ! д: R - С10Н21

R

R

ОСН

= ОСН

=Н;

R, =ОСН в качестве флуоресцентных красителей (флуорохромов ) растительных тканей и микроорганизмов, которые могут быть использованы для изученйя микробиологических объектов, их индикации и диагностики.

Известны флуоресцентные красители растительных тканей и микроорганизмов в различных классах соединений, а именно: акридиновые, азиновые, арилметиновые, ксантеноные (13, (23 и (3) .

Работа с Укаэанными флуорохромами требует соблюдения определенных условий: необходимой концентрации флуорохрома в растворе и окрашиваемого сусбтрата, рН раствора, времени флуорохромирования, Нарушение хотя бы одного из этих условий приводит к искажению результатов опыта.

Кроме того, описанные флуорохромы большей частью растворимы в воде, что создает некоторые трудности при приготовлении постоянных препаратон (при заключении окрашенных объектов .в водные среды). Недостатком флуорохромов является также способность окрашенных ими объектов к ныцнетанию при воздействии ультрафиолетового или обычного света.

Например, как ядерный краситель общего значения используют флуорохром ряда ксантеноных красителей флуоредцеинат натрия (урании A) обладающий характеристиками: 1iAoTh,òîõ =485 490 HMt %погл, юсхх =

527 нм; Ч =0,33) растворимость эО г в 100 г воды и 7 r в 100 г этайола 2

Указанйый флуорохром имеет ряд недостатков: работает в относительно высоких концентрациях (0,00250,01%, разведение 1:40000-1:10000), ego флуоресценция обратимо исчеза55

В табл, 1 приведены физико-химические данные полученных соединений общей формулы

ИК-спектры полученных соединений общей формулы 1 снимают на приборе

"Specord 71-1 R" в вазелиноном масле, а УФ-спектры — на приборе "Specord

UV -vis" с использованием ацетонитрила в качестве растворителя. Квантовые выходы флуоресценции (Qg) при возбуждении светом лп,д„=365 нм определяют по методу Паркера-Риса ° ет при рН(б, окрашенные препараты выцветают под действием ультрафиолетового (5-25 мин) и обычного (12 месяца) света. Кроме того, квантовый выход уранина А (н толуоле)

5 составляет всего 0,33.

В ряду солей пиримидо (1,2-а) бензимидазолия не известны флуоресцентные крастители растительных тканей и микроорганизмов.

10 Цель изобретения — снижение концентрации рабочего растнора флуорохрома, расширение рабочего диапазона рН и повышение устойчивости к обычному и ультрафиолетовому све15 ту, а также повышение квантового выхода.

Поставленная цель достигается использованием предлагаемых перхлоратон пиримидо (1,2-а) бензимидазолия общей формулы н качестве флуоресцентных красителей растительных тканей и микроорганизмов.

Укаэанные соединения получают путем взаимодействия перхлората

2,4,6-триарилипирилия с 1-алкил2-аминобензимидазолом, взятых в мольном соотношении 1:1,2, в кипящем диметилформамиде в течение 1 ч.

Пример 1. Получение перхлората 1-(4-метоксифенил )- -3-фенил5-нонилпиримидо (1,2-а) бензимидазо30 лия (1в) .

О, 88 r (2 ммоль ) н 2, бдифенил-4-(4-метоксифенил)-пирилия ли 0,63 г (2,4 ммоль) 2-амино-135 нонилбензимидазола кипятят 1 ч н

4 мл снежеперегнанного диметилформамида. После охлаждения прили вают 40 мл эфира и отфильтровывают .на плотном фильтре выпавший осадок, 40 Выход соединения ?н 0,77 r (66%), бледно-желтые кристаллы. Вещество перекристаллизовывают дважды из этанола, затем промывают небольшим количеством ацетона и эфиром, Перхлораты 1,3-дифенил-5-октилпиримидо (1, 2-а) бен зимидазолия (1 а), 1-(4-метоксифенил)-3-фенил-5-октилпиримидо-!1,2-а) бензимидазолия (1б), 1,3-дифенил-5-децилпиримидо (1,2-а)—

50 бе нзимидаз олия (I г ) и 1- (4-метоксифенил )-3-фенил-5-децилпиримидо (1, 2-а) бензимидазолия (1д) получают по аналогичной методике.

1051091

В качестве стандарта используют

9,10-дифенил-антрацен в этаноле (1у =0,81).

Изучают флуоресценцию полученных соединений 1а-д в кристаллическом виде и в различных растворителях. Исследования проводят с помощью установки для люминесцентного анализа Л-80. Результаты исследований приведены в табл..2.

Как видно из таблицы, все соединения обладают отчетливой белозеленой флуоресценцией, яркой как в растворах, так и в сухом виде, что дает воэможность использовать их-в качестве флуорохромОв. 15

Для отработки методики флуорохромирования растительных тканей и rpaM-положительных микроорганизмов проводят подбор оптимальных концентраций флуорохрома и оПтималь- 7() ного времени флуорохромирования (на -примере эпидермиса лука и Staphi1ococcus aureus ).

Подбор оптимальных концентрациЯ флуорохромов для окрашивания указан- 25 ных объектов проводят следующим образом.

Готовят растворы соединений общей формулы I различных концентра.ций в 70%-ном этаноле и проводят флуорохромирование препаратов в течение 10 мин. Окрашенные препараты промывают дистиллированноЯ водой и микроскопируют. Результаты приведены в табл. 3.

Интенсивность флуоресценции окрашенных объектов оценивают. визуально по трехбалльной шкале (Π— отсутст» вие флуоресценции; 1 — очень слабая флуоресценция; 2 — слабая, но отчетливая флуоресценция; 3 — интен- 40 . сивная флуоресцеяция)..

Таким образом, предлагаемые в качестве флуорохромов соединений 1 а-д окрашивают в 4-6 раэ меньших по сравнению с уранином концентрациях.

Оптимальная концентрация рабочих . растворов укаэанных соединений

0,0012, что соответствует разделению

1и80000. Увеличение концентрации не влияет на результаты скрашивания» 5Q выпадение кристаллов при подсыхании в процессе флуорохромирования легко предотвратить, используя закрытые камеры для окрашивания препаратов.

Подбор оптимального времени флуо- 55 рохромирования растительных тканей и микроорганизмов соединениями

la-д на примере эпидермиса лука и

5 сарЫ 1ococcus au re us проводят сле- дующим образом.

Готовят растворы соединений Та-д в концентрациях О, 00125 В (разведение 1:80000) и флуорохромируют npe" параты в течение различного времени.

Результаты исследований приведены в табл. 4.

Как видно яз табл. 4, флуорохромирование препаратов наступает достаточно быстро и не ухудшается при увеличении времени скрашивания до

15 мин. За оптимальное время выбирают интервал 10 мин, так как за это время происходит почти полная фиксация микроорганизмов. Для растительных тканей достаточно 3-5 мин.

Свойства перхлоратов пиримидо (1,2-а) бензимидаэолия общей формулы Т как флуорохромов изучают по следующей методике.

Для флуорохромирования готовят тонкий срез плотной растительной ткани или мазок культуры микроорганизмов. Приготовленный препарат заливают на предметном стекле 1-2 мп . спиртового раствора (на 70%-ном этаноле) перхлората пиримидо (1,2-.а бензимидазолия (рабочее разведение

1:40000-1!80000 концентрация

0,90125-0,0025%). Время флуорохромирования 10 мин (для фиксации микроорганизмов). Окрашенные мазки или срезы промывают дистиллированной водой, накрывают покровным стеклом и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа МЛ-2 в ультрафиолетовых лучах (Я =320-390 нм).

Выбор известных флуорохромов для сравнения с предлагаемыми соединениями производят как по общепринятым для этих флуорохромов методикам, так и по описанной методике.

Результаты испатыний даны в табл. 5.

Как видно из данных табл. 5, наи более близким к предлагаемым соединениям по окрашивающей спбсобности, цвету и интенсивности флуоресценции является урании.

Перечень изучаемых объектов приведен в табл. 6. Оценка интенсивности флуоресценции такая же, как в табл. 3 °

Как видно из табл. 6, предлагаемые соединения активно флуорохромируют растительные ткани, грибкиактиномицеты и .грам-положительные микроорганизмы. Для флуорохромирования грам-отрицательных микроорганизмов яеобходим подбор специальных условий.

Полученные результаты подтверждают положение о том, что грам-положительные бактерии связываются с флуорохромом энергичнее и прочнее, чем грам-отрицательные. Поэтому данная методика может быть использована для быстрой предварительной идентификации микроорганизмов по Граму.

Кроме того, установлено, что предварительная фиксация в течение, 1S мин 70%-ным-этанолом и совмещение фиксации с флуорохромированием

1051091 не влияют на люминесцентную картину объекта.

Изучают действие различных фиксаторов, окислителей и восстановителей, а также различных кислот и щелочей в целях установления мешающих факторов и диапазона рН, оптимального дпя флуорохромирования (см. табл. 7).

Таким обраэом, .непродолжительное действйе (не более 5 мин) описаннь5в факторов не оказывает отрицательного влияния на люминесцентную картину препаратов.

Изучают также влияние ультрафиолетового и обычного света на качЕство флуорохромированных препаратов. Длительное (в течение 2 ч )

УФ-облучение, а также продолжитель- о ное (свыше 10 месяцев) хранение заключенных препаратов не приводят к ухудшению флуоресцентной картины, если таковая имеется после приготовления постоянного препарата.

Таким образом, предлагаемые в качестве флуоресцентных красителей растительных тканей и микроорганизмов перхлораты пиримидо (1,2-а) бензимидаэолия общей формулы T в низких концентрациях (0,006.-0,0012%) имеют широкий рабочий диапазон рН (3-9), устойчивы к длительному воздействию ультрафиолетового (более

2 ч) и обычного (свыше 10 месяцев) света, обладают высоким квантовым выходом (до 0,56), а также устойчивы к воздействию факторов, потенциально влияющих на флуорохромирование .

3 !

% о

Ц о х х

0%

«T

C) 4

«3

Ъ

4%4

4%4 Ь

C) \О аА

Ю

:» и

0% л

ЧЪ

«4%

Ю

«4 м

Ю л

«

° 4

С%4

° 4 м

«У

«4 м

lA м

ЧЪ

М

«3

О\ м м

«Ч

%О

М

«4

Cl

«Ф м

Ю

Ю

%О

%-4

М

Ю и

1% х

Ф г. оI !

С х

Ю м

Ю

%-4

%-4

%-4

l6

Ц о

Ф

1«

Ф м с

1О

Ю

ЧЪ аА

\О м с

%О

Ю

1О

Ю с ао

%О Ф с сО

%О

Ю л

4«

Лю: 4

% °

4%

X:

Ю

Ю т

«

44

<.Э х

%%

1.Э м с л (О с л

4%4

М л

«3 л м

CO м

%О

М (O

%О м с

1О

ЧЪ

3«Ъ

I м аА

Ю

%-4

ЧЪ

02 4 м

ЧЪ

I м

%О

%-4

ЧЪ

СО

%-4

lA

CO т 4

Ov ж

9 и

«

4%

Ж о

« х

ОО и и о ж и о и о и «

1 о е

I

I X

I !

Г

1 . О

I 1

° Х I« 1 кохк

ОФФИС !

С 0 Ф Х (%4

lA

Са

° 4

%-4

М

Ю л

«3

%" 4

«

lA О

lA

Ю

Ю

%О

%-4

М

Ю

%-4

%0

%-4

Ч \ м

%О

% «

Ю

СО

<«4

%-4

Ю

tE м

%4

М аА

%О аА

%-4 с

Ю л

lA

%-4

Ю

%-4

ЧЪ

%-4

Ю м аО

%-4 м

М л

%4%

Ю

44% м

4.Э

EJ

%4 м

% 4

° %

an Ю

° 4% %-4

° 4 ° 4

IA tA

«Ч 1 аА 4%4

%4 %4

О о

%О

%Ч

М о

%4

%О

%-4

Ю

4 Ъ

Ю

%-4

%Л

Ю

«-4

° 4

%4

М

Ю л

«У

Ю

1О аА

%-4

Ю о

%О

%-4

Ю

%-4

%О

%-4

М

Са м

%-4

%-4

Ю

Ч%

C)

%%

Ж

%З

%О х

% %

«%

Ю

Ю

%О

4%4

%4Ъ

% 4

44

ЧЪ

%-4 с

ЧЪ

Ю м

% 4 л о

««

«У %-4

%-4 %-4

М Ъ а ЧЪ ч»

ЧЪ 4Ч

«4 %-4

Ф х х

Ф

r х

Ц

Ф о

2 х и х а а

4С х х

Ц

Ф о

1051091

10.

I !

I

1

1

I"

I

1

I

М ! 4 с! ос! о он не с! I кк

g Ф Фе

U ах оы

5 е в:!

Ц х о в

М к

I с с

1. !

Г= — !

I A 1 он

ltI O но о й

I <бх! аа

1 l

tk с!

Э к

Э

tt

М к о н

v о о

1 о аж о м ь и

I

1

l

1 !

1

I

I

1

1

1 с

l 1 с с

1 I и

1 4 он с! v н с! Х аа

+ + + о

Се о

1

1

63 5 ож ж

О Э Ф

Ф к к о !с я о

Э ам ои

WL к е

O N! с

1! 1 с с

1 1 н

v х а

l f

I Ф он с! v аа

I о пх ом

В

v а о, Фь

I I с с

1 х о

Ф

Х

Ж Э

Ф

Ф 0) о о

v с х

Ф с

Itt М (4 о х

Ю И

М

ltI

Ф

Ф

Я

Щ а

1 A о но

C L аа

+ +! +

I

1

1

I

1 о

1 Ж ое

Х К I! е

1 Ф

Ц о ф

r

I

l !

1

1

I s!I: он

ttt U I

v3 с!Я I.1! +!

Н 1 м о

w н

М е к

©

Ф ! н о и

Ц

Ф Ф он

Г \ а ! о

СЧ ф ь н о оа

53 оа н

1 о

+ + + + +

Itl 4 Ц еч н

xg ей ао о о о

4 а х н м

5 а ох ао и о

Ф с а+

t с

03 М н н

v v но

:ь X ох на о

Itt н о с! Ф а.

Р с! к

I U

1 с

+I с

1051091

Таблица3

Подбор оптимальных концентраций для флуорохромирования растительных тканей и микроорганизмов (на примере эпидермиса лука и 5taphi1ococcus aureus).

Концентрация флуорохрома, Ъ кт исследования

О, 0012 О 0006.0,02 0,01 0,005 0,0025

Урании Растение

Микроб

Растение

Микроб

Растение

Микроб

Растение

Микроб

Растение

Микроб

Растение! .2

3

1б

3

3 1в

1г

3! д

Микроб

Ф

Наблюдается выпадение кристаллов при подсыхании флуорохромируемого препарата через 10 мин.

ТаблИца4

Подбор оптимального времени флуорохромнрования соединениями ! а-д (на примере эпидермиса лука и Stapbi lococcus aureus) Объект исследования

Время Флуорохромирования, мин

Соединение

30 с 1

3 5

ia

Растение

3

3

Микроб

Растение

).б

3

3

2

Микроб

Растение

3.3

3 3

Микроб

Растение

Микроб

Растение

1д

Микро

1051091

+красн„, краси. зел, +жел.

+зел.— жел.

Азиновые красители сафранин

+сл.эел.

+сл.эел.

КсантенОвые красители пиро нин

+сл.кр. +краси, +красн.

+краси. флуоресцеин

+эел. уранин

+эел.

+вел.

+зел.

+эел, Тиаэоловые красители примулин

+эел.

+зел.

+зел. тита новый желтый

+сларо

Класс объектов

Эп астительные ткани

Акридиновые красители акридиновый оранжевый

Эпидермис алоэ

Лист пандануса

«+ сл. эел. +эел.

Таблица 5

t Таблица б

1051091

Окрашивание

Класс объек» тов в 70%-ном спирте

Кровь человека йивотные ткани

О.

0

Микроорганизмыы

Hucor sp.

3,3

0

0

Объект исследования. Эпителий слизистой человека

Почечный эпителий зел.март.

Тучные кл. мышц

Кератин волос и ногтей

Хитин панциря рака

Хитин насекомых

А spergt I lus awamori

Aspe гд i I l us,sp.

PenIcI11Ium sp.

Saccharomyces sp.

CandIda sp.

Васlllus subti1ls

Bacillus anthracoIi1es

Lac tobac i 11us ас1dophy I мз

Lactobac111us plantarum

Proteus mi rabl l la u vul ger I s

Escheг I сЫ Ь col I

Sa lmone l Ia typhlmur ium

Sa imone11a paratyphI А

ShlgeI la F Ie»nerI

Shige1ia Sonnei

ShlgeI1а GrIg.«Shlg.

Serratla marcescens

Продолжение табл, 6 с предварительной фиксацией

70Ъ- ного спирта

1051091

Продолжение табл. 6

V1brio El-tor ".1паЬа"

Ч IÜãio Еl-tor "Ogawa"

NA G-Ч!.b r l o

Sere I nae sp.

Staphi 1ococcus albus

Staphllococcus aureus 209P

Staph! 2ococcus ерl derml Ы s

MI crococcus lysodect l cus

Kl ebs i e I I а pneumonlae эрографироваиие юю Ф

Ухудшение ггение

Фиксаторы (спирты и их смеси):

70%- ный этанол ,смесь метанолгэтанол (1г1) Нет

Нет н

11 метанол

Смесь этанол г ацетон (1 г 1 ) смесь этанол:эфир (1г1) смесь эт анол г уксусная кислота (99 г 1 ) сгдесь этанолгтрихлоруксусная кислота (99г1)

Окислители и восстановнтелиг аскорбиновая кислота 1% нет нет

I перекись водорода 1% щавелевая кислота 1% л

Кислота и щелочи:

Таблица 7

Действие факторов, потенциально ввияквгих на флуорохромирование соединениями общей формулы.2

19

1051091

Продолиение табл.7

Фактор

Ухудшение

Улучшение да

° 1 уксусная кислота 1% едкий натр 1% нет трихлоруксусная кислота 1% да! ° серная кислота 1% нет соляная кислота 1% фенол 1%

+ да до, так и после флуорохромирования. Результаты, помещенные, приведены для грамотрицательных микроорганизмов, s частности

Е.coli. Удается вызвать слабую,флуоресценцию грам-отрицательных микроорганизмов, заменив растворитель 70%-ный этанол диметилсульфоксидом, однако полученные данные нельзя считать удовлетворительными.

Составитель Н. Нарышкова

Редактор Н. Кешеля Техред A.Áàáèíåö Корректор A. Ильин

Заказ 8597/26 Тирам 418 Подписное

BHHHlIK Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Филиал ППП "Патент", Г. Уагород, ул. Проектная, 4

П р и м е ч а н и е. Действие фиксаторов осуществляют до флуорохромирования, остальных соединений - как