Способ получения инсулина человека

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К AATEHTV.(21) 3582755/28-14 .(22) 20 04.83 (31) 8201650 (32) 21.04.82 (33) ИТ (46) 15.05.86. Вюл. Ф 18 (71) Акцо Н.В. (72) Гейсберт Виллем Карел ван Дедем и Франсуа Эгберт Абрахам ван Хауденховен (53) 615.45{088.8) (56) Sehnitt Е ы. et al. Hoppe Seylers

Z.-Physiol. Chemil, 1978, v. 359, р. 799.

GQ И1)

SU (Ю4 С 12 Р 21 00 А 61 К 37/26 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА

ЧЕЛОВЕКА, отличающийся тем, что, с целью повыюения чистоты и упрощения способа, модифицированный инсулин человека общей формулы

О дез (ВЗО)-инсулин- au -г.н - C --R

1 нс-сн, 1

ОН где R — фенилаланил-фенилаланин, подвергают обработке карбоксипентидазой А с последующим выделением целевого продукта.

1232148

ВНИИПИ Заказ 2666/61

Тираж 490 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к биохимии, в частности к получению инсулина человека полусинтетическим путем.

Цель изобретения — повЫшение чистоты и упрощение способа получения инсулина человека за счет использования модифицированного инсулина общей формулы.

1 дез (ВЗО) -инсулин- NH - С Н - С - R

I нс-сн

ОН где R — фенилаланил-фенилаланин, который подвергают обработке карбок- 1э сипептидазой А, специфически отщепляющей остаток Й с образованием инсулина человека.

Способ осуществляется следующим об-. разом. 20

Пример 1. В качестве исходного соединения используется дез(ВЗО). †.

-инсулин (ДАИ), получаемый из инсулина свиньи по методу Schmitt. Сначала проводят связывание ДАИ с три- 25 пептидом Ьг-phe-phe. В качестве реакционной среды используют смесь, состоящую на 67Х из органической фракции (смесь диметилформамида и этанола 1: 1) и на 33Х из 0,5 .М трис-НС1 З0 буфера ° В этой среде растворяют навеску ДАИ до концентрации 13 6 г/л и навеску трипептида до концентрации

0,067 М. С помощью 0,1 М раствора

NaOH доводят рН полученной смеси до

6 5. Затем в раствор вводят трипсин . до концентрации 5 г/л и реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение

35 мин. ДАИ-thr-phe-phe вьделяют из реакционной системы хроматографичес- 40 ким способом и подвергают лиофилизации. Выход составляет 54Х. ДАИ-thrphe-phe растворяют в 0,2 M растворе бикарбоната аммония с рН 8,5 до концентрации 2,8 мг/мл. К этому раствору 45 добавляют 2 мкл (2,3 Е) карбоксинептидаэы. Ферментативную реакцию останавливают через 30 мин путем добавления равного объема 0,5 М раствора лимонной кислоты. Образующийся инсулин человека вьделяют с помощью кристаллизации.

Пример 2. ДАИ растворяют в среде, состоящей на 60Х из органической фракции (см. пример 1) и на 40Х иэ 0,5 М трис-НС1 буфера до концентрации 32,2 г/л. Затем в этой среде растворяют тринептид thr-phe-phe-НС1 до концентрации 0,047 М. С помощью

О,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,5. После этого в раствор вводят иммобилизованный на силикагеле трипсин до концентрации

157 г/л и реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение 3 ч. ДАИ-thr-phe-phe вьделяют хроматографическим способом и подвергают лиофилизации.

Выход препарата 27Х; Превращение ДАИ-thr-phe-рЬе в инсулин человека и выделение инсулина проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. ДАИ растворяют в среде, составленной по примеру 2, цо концентрации 25,2 г/л. Затем растворяют трипептид thr-phe-phe-НС1 до концентрации 0,037 И. С помощью

0,1 М раствора NaOH доводят рН полученной смеси до 6,3. После этого в раствор вводят иммобилизованную на силнкагеле лиэилзндопептидаэу до концентрации 77 г/л и реакционную смесь инкубируют при 37 С в течение

48 ч. ДАИ-thr-phe-phe вьделяют хроматографическим способом и подвергают лиофилизации. Выход препарата

38Х. Превращение ДАИ-tbr-phe-phe в инсулин человека и выделение инсулина .проводят по примеру

Идентичность получаемого препарата с инсулином человека подтверждена данными аминокислотного анализа, свидетельствующего о полном соответствии аминокислотного состава, получаемого препарата и инсулина человека. Высокая чистота (гомогенность) получаемого препарата инсулина человека доказана методом жидкостной хроматографии высокого давления (один основной пик при времени удержания

1089),