Способ определения иммунореактивности соединений, меченных радиоизотопами

 

Изобретение относится к области радиоиммунного анализа. Цель изобретения - повышение воспроизводимости способа. В контрольные пробирки вносят испытуемое меченое вещество, а в опытные пробирки вносят растворитель. После инкубации в опытные пробирки прибавляют испытуемое меченое вещество. Разделяют фракции свободного и связанного с антителами меченого вещества и определяют радиоактивность связанного меченого вещества в контрольных и опытных пробирках. Рассчитывают долю связанного вещества в опытных и контрольных пробирках и затем определяют величину иммунореактивности. Способ можно использовать для комплектации серийно выпускаемых наборов реактивов для радиоиммунного анализа.

Изобретение относится к радиоиммунному анализу, а именно к способам определения иммунореактивности соединений, меченных радиоизотопами и предназначенных для радиоиммунного анализа. Специфической характеристикой качества меченого вещества как компонента радиоиммунологической системы является его иммунореактивность, т. е. способность связываться со специфическими антителами. Количественным выражением иммунореактивности является величина, определяющая долю вещества, способного образовывать комплекс со специфическими антителами. Целью изобретения является повышение воспроизводимости способа за счет исключения влияния фактора авидности антител. Для осуществления способа используют ряд пробирок, содержащих одинаковые количества антител в концентрациях, обычно применяемых для радиоиммунного анализа меченого вещества, структурно аналогичного испытуемому меченому веществу. В контрольные пробирки вносят раствор испытуемого меченого вещества в количествах (по радиоактивности), обычно используемых в радиоиммунном анализе, а в опытные пробирки вносят такой же объем растворителя. Содержимое всех пробирок инкубируют в одинаковых условиях. Для удаления фракции свободного меченого вещества из контрольных пробирок опытные и контрольные пробирки обрабатывают в одинаковых условиях. В опытные пробирки прибавляют испытуемое меченое вещество в количествах, равных количеству связанного с антителами меченого вещества (по радиоактивности) в контрольных пробирках. Все пробирки инкубируют в одинаковых условиях до достижения равновесного распределения меченого вещества между свободным и связанным состояниями. Во всех пробирках фракции свободного и связанного с антителами меченого вещества разделяют в одинаковых условиях и определяют радиоактивность связанного меченого вещества в контрольных и опытных пробирках. Рассчитывают долю связанного вещества в опытных (А) и контрольных (В) пробирках и находят величину иммунореактивности по отношению _{· 100%} П р и м е р 1. Определение иммунореактивности препарата трииодтиронина, меченного иодом 125 (¹²⁵ I - Т₃). В две пары пробирок (опытные и контрольные) вносят по 500 мкл раствора антител, специфичных к трииодтиронину (≈0,1 нмоль) в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 6,7, содержащем 2 мг/мл яичного альбумина. В контрольные пробирки вносят 50 мкл раствора испытуемого препарата (75000 расп/мин) в вышеуказанном буфере, а в опытные пробирки 50 мкл раствора того же буфера. Инкубируют содержимое пробирок 1 ч при 20^оС. Разделяют свободную и связанную с антителами фракции ¹²⁵l-трииодтиронина инкубацией содержимого пробирок со 100 мкл 2,5% суспензии активированного угля, покрытого декстраном, в дистиллированной воде при постоянном помешивании в течение 10 мин при 20^оС и центрифугировании в течение 10 мин в центрифуге с горизонтальным ротором при 2000 g. Из всех пробирок надосадочные жидкости переносят в чистые пробирки (пробирки с осадком угля отбрасывают) и измеряют радиоактивность в контрольных пробирках. В конкретном эксперименте эта величина составляет 38000 расп/мин. Вносят в опытыне пробирки 50 мкл раствора испытуемого препарата (38000 расп/мин) в описанном выше буфере, а в контрольные пробирки 50 мкл раствора того же буфера. Инкубируют содержимое пробирок 1 ч при 20^оС. На этой стадии в контрольных пробирках присутствует ¹²⁵l-трииодтиронин, иммунореактивность которого составляет 100% , так как после первой инкубации в эти пробирки переносят только связанное с антителами меченое вещество. Таким образом в контрольных пробирках присутствует эталонный образец вещества (3800 расп/мин), связывание которого со специфическими антителами впоследствии сравнивается со связыванием испытуемого исходного препарата (38000 расп/мин). По окончании второй инкубации разделяют свободную и связанную с антителами фракции ¹²⁵l-трииодтиронина добавлением по все пробирки 50 мкм 1% раствора γ-глобулинов кролика в 0,1 М натрийфосфатном буфере рН 6,7 и 1 мл полиэтиленгликоля (Мол. масса 6000) в том же буфере и центрифугированием в течение 15 мин в центрифуге с горизонтальным ротором при ускорении 2000 g. Супернатант отбрасывают и измеряют в осадке радиоактивность связанной фракции ¹²⁵l-трииодтиронина. Средняя величина радиоактивности в опытных пробирках (А) составляет 22000 расп/мин, в контрольных пробирках (В) - 25000 расп/мин. Рассчитанная по формуле 125(¹²⁵-1-T₃)100% иммунореактивность испытуемого препарата составляет 88% . П р и м е р 2. Определение иммунореактивности препарата прогестерона, меченого иодом - 125 (¹²⁵I - Р). В две пары пробирок (опытные и контрольные) вносят 500 мкл 10% -ной суспензии сефарозы с иммобилизованными на ней антителами, специфичными к прогестерону ( ≈0,4 нмоль) в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 6,7. В контрольные пробирки вносят 50 мл раствора испытуемого препарата ¹²⁵l-прогестерона (60000 расп/мин в вышеуказанном буфере, содержащем 2 мг/мл, бычьего сывороточного альбумина (БСА), а в опытные пробирки - 50 мкл того же буфера. Инкубируют содержимое пробирок, перемешивая 2 ч при 20^оС. Разделяют свободную и связанную с антителами фракции ¹²⁵l-прогестерона осаждением сефарозы и удалением супернатанта, содержащего свободную фракцию, из всех пробирок. Измеряют радиоактивность осадка в контрольных пробирках. В конкретном эксперименте эта величина составляет 30000 расп/мин. Вносят в опытные пробирки 50 мкл испытуемого раствора ¹²⁵l-прогестерона (30000 расп/мин) в фосфатном буфере, содержащем 2 мг БСА в 1 мл, а в контрольные пробирки - 50 мкл того же буфера с БСА. Приливают во все пробирки 500 мкл указанного буфера, содержащего БСА, и инкубируют содержимое пробирок, постоянно перемешивая 2 ч при 20^оС. Как и в примере 1 на этой стадии в контрольных пробирках содержится меченое вещество, иммунореактивность которого составляет 100% . По окончании инкубации разделяют свободную и связанную с антителами фракции ¹²⁵l-прогестерона осаждением сефарозы (содержащей связанные фракцию) и удалением супернатанта. Измеряют радиоактивность осадка в контрольных (В) и опытных (А) пробирках. Средняя величина радиоактивности в контрольных пробирках составляет 15000 (В) расп/мин и средняя величина радиоактивности в опытных пробирках - 14000 расп/мин (А). Рассчитана иммунореактивность испытуемого препарата так же, как в примере 1. Она составляет 93% . Изобретение можно использовать для комплектации серийно выпускаемых наборов реактивов для радиоиммунного анализа, так как способ позволяет с высокой воспроизводимостью определять изменения в иммунореактивности меченых препаратов в процессе их хранения, в то время как воспроизводимость известных способов зависит от свойств используемой антисыворотки. (56) J. Clin. Lab. Juvest, 1983, v. 43. п. 483-491.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ СОЕДИНЕНИЙ, МЕЧЕННЫХ РАДИОИЗОТОПАМИ, путем разведения антисыворотки, внесения ее и испытуемого вещества в пробу инкубирования, разделения прореагировавших и непрореагировавших антител и антигенов, подсчета радиоактивности комплекса антиген-антитело, расчета иммунореактивности, отличающийся тем, что, с целью повышения воспроизводимости способа за счет исключения влияния фактора авидности антител, предварительно проводят инкубацию в опытной пробе, определяют радиоактивность образовавшегося комплекса антиген - антитело, в контрольную пробу вносят радиоактивное вещество в количестве, равном по радиоактивности комплексу антиген - антитело в опытной пробе, повторно инкубируют, разделяют образовавшиеся комплексы антиген - антитело в контрольной и опытной пробах.