Способ получения дигиталис-антител

 

Изобретение относится к области иммунохимии и относится к способу получения дигиталис-антител. Целью изобретения является повьшение специфичности антител и степени очистки от эндотоксинов. Способ осуществляется получением специфической антисьшоротки, вьщелением гамма-глобулина , им ryнocopбIщй на иммуносорбенте, представляющем пористое стекло , или силикагель или окись алюминия с объемом пор 1-20 , в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, и расщеплением папаина на иммуносорбенте. При этом дигиталис-антитела элюируют с иммосорбента водной кислотой после предварительного промывания раствором с рН 6,0-7,5. Полученные антитела дополнительно очищают гель-хроматографией на сефакрипе-200 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-32. Специфичность полученных антител повышается на 18-20%. О)

СОЮЗ СОНЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (51) 4 A 61 К 39/395

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3817568/28-14 (22) 23. 11.84 (31) P 3342870.0 (32) 26.11.83 (33) DE (46) 30.01.89. Бюл. N- 4 (71) Берингер Маннхайм ГМБХ (DE) (72) Ханс-Георг Бац, Херберт !0нгфер, Хельмут Ленц и Альберт Бедер (DE) (53) 615.373(088.8) (56) Proc. Nat.Àñàd. Sci. US. 1971, v. 68, р. 2401-2406. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИГИТАЛИСАНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к области иммунохимии и относится к способу получения дигиталис-антител. Целью изобретения является повышение специфичности антител и степени очист1

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунохимии и касается способа получения дигиталис-антител.

Целью изобретения является повышение специфичности антител и степени очистки от эндотоксинов.

Пример 1. Получение овечьей аптидигоксиновой сыворотки.

Иммуноген.

Дигоксин-глутарил-о-оксисукцинимид в водном растворе вводится во взаимодействие с протеином, особенно с бычьим глобулином или эдестином (протеином из семян конопли). После отделения избытка производного дигоксина несколько молекул дигоксина на молекулу протеина с концевой ди„,80 „„145599 ки от эндотоксинов. Способ осуществляется получением специфической антисыворотки, выделением гамма-глобулина, иммуносорбций на иммуносорбенте, представляющем пористое стекло, или силикагель или окись алюминия с объемом пор 1-20 м /г, в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, и расщеплением папаина на иммуносорбенте. При этом дигиталис-антитела элюируют с иммосорбента водной кислотой после предварительного промывания раствором с рН 6,0-7,5. Полученные антитела дополнительно очищают гель-хромато- . графией на сефакриле-200 и ионообменной хроматографией на ДЕАЕ-целлюлозе ДЕ-32. Специфичность полученных антител повышается на 18-20Х.

2 гитоксозой через глутарильную цепь связываются с протеином.

Иммунизация.

0,5 мг дигоксин-иммуногена в полном аднованте Фрейнда вводятся внутрикожно здоровым овцам весом не менее 45 кг. Сначала через каждые 2 недели и затем через каждые 4 недели иммуноген в .таком же носителе снова вводится внутримышечно и подкожно для повышения иммуноответа.

Спустя 2-4 мес достигается титр в apl сывор отке животных 1 мг диг оксинспецифического иммуноглдбулина/мп.

Отбор сыворотки, аналитика, образование пула. з 145

У здоровых животных, которые доСтигли при отборе пробы указанного титра, минимально в течение года еженедельно можно отбирать кровь из шейной вены. В выборочных пробах отбора постоянно контролируется титр с помощью радиоиммунного .теста нли с помощью ферментоиммунного теста.

Константы связывания также определяются в выборочных пробах путем оценки связывания радиоактивно маркированного дигоксина путем определенных разбавлений антисывороточных Проб. В соответствии с литературой получаются величины 5х10 -5х10 л/моль.

Дпя того чтобы поддерживать по возМожности незначительными колебания составе используемой для выделения

AH-фрагментов антисыворотки, собиаются количества 20-50 л из отдельых отборов нескольких овец.

2. Приготовление иммуносорбента.

Содержащее амино-группы стекло.

Для удаления мелких частиц и примесей 940 r пористого стекла с поверхностью 10 м /г обрабатывают в водной суспензии ультразвуком, затем нагревают в течение 3 ч в среде

65%-ной азотной кислоты при 80-90 С.

1 осле вымывания кислоты стекло высушивают при 150 С. Очищенное стекло медленно с обратным холодильником перемешивается в 2,7 r безводного диметилсульфоксида с 300 мл 3-(триэтоксисилил)пропиламина в течение

20 ч при 85 С. Избыточный силиламин вымывается изопропанолом и аминироВанное стекло снова высушивается (60 С, небольшой вакуум) . Выход примерно 1,8 г аминопропильного стекла (750 г).

Окисление дигитоксина.

6 г дигитоксина в 450 мл смеси этанола с водой (2:1) подвергают взаимодействию со стехиометрически равным количеством перистата натрия

1, 1,7 г) в течение 20 ч при комнатной температуре. Нерастворимый осадок отфильтровывают и удапяют. Надосадочную жидкость упаривают досуха на ротационном испарителе. Остаток проь|ывается 2х100 мл воды, затем высуШивается в вакууме над хлоридом каль.— ция. Выход 4-5 г окисленного дигитоксина.

Адсорбент дигитоксин-стекло.

4,5 г окисленного дигитоксина растворяют в 2,25 л смеси этанола

5999 с водой (2:1), смешивают с 750 г аминонропильного стекла и медленно перемешивают в течение 20 ч при комнатной температуре ° Стекло отфильтровывают. Дигитоксин определяют путем измерения экстинкции в УФ-области (260 нм) и по полученным данным вычисляют количество фиксированного дигитоксина (заданное значение: 3 мг дигитоксина на мл объема стекла).

4 r боргидрата натрия растворяют в

1 л бидистиллированной воды, разбавляют 2 л этанола и подают на модифи5

10 цированное дигитоксином стекло. При многократных встряхиваниях в течение

2 ч при комнатной температуре устанавливают рН 7,0-7,4 путем добавления 2 мМ соляной кислоты. При этом сначала фиксированному на стекле через лабильные связи типа шиффового

20 основания дигитоксину сообщается прочная степень фиксации. Полученный иммуносорбент тщательно промыва26 ют этанолом, водой, этанолом, затем высушивают в слабом вакууме. Выход

1,8 r иммуносорбента.

Подготовка иммуносорбента для непосредственного употребления.

З0 Сорбент суспендируют в буфере А (50 ммоль фосфата с рН-7,0/0,15 М хлористого натрия/0,1 азида натрия), подают в стеклянную колонку с фриттой и последовательно промывают раствором 0,5 M хлористого натрия и 0,05%-ного твина-20, бидистиллированной водой и 1 M пропионовой кислотой, наконец, уравновешивается буфером А. Использованный иммуносор40 бент регенерируют путем промывки 1 И пропионовой кислотой, после чего хранят в буфере А при 4 С. Сорбент можно использовать многократно. Непосредственно перед употреблением

45 свежий сорбент предваритепьно промывают.

3. Получение овечьего антидигоксин-ФАБ-фрагментов.

Используемые раетворы .стерилизуют

50 в автоклавах или путем мембранной фильтрации. Используемая для приготовления растворов вода пирогеносвободна за счет дистилляции. Емкости, приборы, а также другие вспомогатель5 ные материалы (например материалы для хроматографии) становятся пирогенно-свободными за счет нагревания или же путем обработки 0,,5 И гидроокиси натрия. гаемым способом антитела имеют специфичность, которая на 18,27 превышает специфичность антител, получаемых известным способом, Кроме того, получаемые предлагаемым способом антитела также имеют более высокую степень чистоты, о чем свидетельствует сравнение данных по содержании эндотоксина (см.таблицу) °

Пример 2. Повторяют пример 1, с той лишь разницей, что в разделе ? используют силикагель с поверхностью 20 м /г. При этом очистку исходного силикагеля осуществляют путем трехкратного суспендирования в 2 л слабо подкисленной азотной кислотой воды с последующим декантированием мелких компонентов на каждой. стадии. Получаемые дигиталисантитела имеют то же качество, что и антитела примера 1.

Пример 3. Повторяют пример 1, с той лишь разницей, что в разделе 2 используют гель окиси алюминия с поверхностью 1 м /I При этом очистку исходного силикагеля осуществляют путем трехкратного суспендирования в 2 л слабо подкисленной азотной кислотой воды с последующим декантированием мелких компонентов на каждой стадии. Кроме того, иммуносорбент используют в разделе 3 в количестве

5,0 л. Получаемые дигиталис-антитела имеют те же качества, что и антитела примера 1.

Пример 4. Повторяют пример

1 с той лишь разницей, что стадию элюации ФЛБ-фрагментов осуществляют: а) 3 ммоль водной фосфорной кислоты или б) ммоль водной уксусной кислоты, или в) 2 ммоль водной серной кислоты, Получаемые при этом дигиталисантитела имеют те же качества, что и антитела примера 1.

Пример 5. Повторяют пример 1, однако в качестве растворителя для адсорбции.и расщепления папаином применяют лишь буферный раствор ацетата натрия и уксусной кислоты (0,5 М, рН 6,0). Расщепление папаином проводят тем, что раствор

240 мг папаина в 2 л этого буфера подают прямо на колонку, гри этом жидкость пропускают приблизительноза 30 мин и непосредственно после этого пропускание прекращают и раст- . вор еще 5 ч загружают колонку. Непо35

7 1455999 8

800 мл концентрируют путем ультрафильтрации до объема 150 мп, затем диализуют по отношению к буферу (15 Им фосфата, рН 7,5/0,15 M хлористого натрия).

Хроматографию повторяют дпя второй части ФАБ-лиофилизата на той же колонке. Обе хроматографированные части снова объединяют для дальнейшего использования. Промежуточное хранение первой части осуществляют при

-20 С.

Пропускание через ионообменник (4 С) . !

400 мн целлюлозы марки DE-52 (предварительно обработанной 0,5 н НС1 и 0,5 н. Na0H для стерилизации и освобождения от пирогена) подают в колонку и уравновешивают 10 ммоль фосфатного буфера с рН-7,1. ФАБ-протеин с предыдущей стадии путем ультрафильтрации доводят до концентрации

50 мг/мп и затем пропускают через колонку. ФАБ-протеин вытекает почти незамедлительно, следы посторонних протеинов. (например альбумина, ФСфрагменты и т.д.) удерживаются. ФАБпротеин в стоке собирают, в случае необходимости концентрируют путем ультрафильтрации до 15-20 мг протеина/мп, на электроде значение рН доводят до 7,0-7, 1 и стерильно фильт руют через мембранный фильтр с вели- . чиной 0,2 ммк. Конечный выход 5-6 г овечьего антидитоксинового ФАБ. Отфильтрованный стерильно целевой продукт запивают в стеклянные емкости при отсутствии микроорганизмов и хранят при -20 С.

Дигиталис-антитела, получаемые в примере 1, содержат 84,8 мг белков в ампуле и имеют связывающую ем-. кость, равную 0,013 мг дигоксина/мг

ФАБ-фрагментов. Кроме того, содержа- 45 ние эндотоксина (белковой примеси, которая может вызвать. лихорадку и аллергические эффекты) в ампуле составляет 0,22 единицы. Дигиталисантитела, получаемые известным способом, имеют следущие качества: содержание белков 43,8 мг; связывающая емкость 0,011 мг дигоксина/мг ФАБфрагментов; содержание эндотоксина в ампуле 12,8.

Сравнение данных по связывающей емкости, являющейся мерой специфичности дигиталис-антител, свидетельствует о том, что получаемые предлаПредварительная очистка овечьей антидигоксиновой сыворотки „

30 л антисыворотки перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре вместе с 300 r аэрозоля для удаления липопротеинов. После отделения аэрозоля путем центрифугирования из охлажденной до 4 С надосадочной жидкости путем добавки твердого сульфата аммония до концентрации

i,8 М осаждают гамма-глобулины. Путем центрифугирования собирают осадок, растворяют в растворе О, 15 М хлорида натрия (О, 1Х азида) и диализуют по отношению к буферу (15 мМ фосфата, рН 7,1/50 мМ хлористого натрия/0,002X гибитана) при 4 С.

Диализат подают яа 16,2 л колонки с диэтиламиноцеллюлозой (ДЕ-52) и элюируют буфером того же состава, что и буфер для диализа. Выходящий из колонки вместе с этим буфером протеин представляет собой служащую дпя выделения ФАБ-фрагментов иммуноглобулиновую фракцию из овечьей антидигоксиновой сыворотки. Выход протеина составляет 500-700 r. Содержание дигоксин-специфических антител примерно 80-90 исходного титра в сыворотке.

Специфическая адсорбция.

250 г иммуноглобулиновой фракции в 10 л раствора с содержанием дигоксин-специфического иммуноглобулина, равным 15 r подают в буфер 50 ммолей фосфата/0, 15 М хлористого натрия/0,0027 гибитава (pH 7„0, буфер Б)

Этот раствор при комнатной температуре в течение примерно 2 ч прокачивают через колонку, заполненную 2,4 л указанного иммунсорбента. Специфические иммуноглобулиновые фрагменты связываются íà 90Х с адсорбентом.

Адсорбент промывают буфером Б, к которому добавляют еще 0,35 M хлористого натрия и 0,05Х--ноге твина-20, saтем уравновешивают буферам В (85 ммоль фосфата, рН 7,0/0,15 моль хлористого натрия/ 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты/10 мИ цистеина/0,01X гибитан;.:, который пригоден для последующего расщепления папаином, Ферментативная фрагментация.

Нагруженный специфическим к дигоксину иммуноглобулияом адсорбент сразу переводят в стеклянные емкости и смешивают с 240 мг папаина, 145 5о99 6 растворенного в 2 л буфера С. При медленном перемешивании с помощью лопастной металлической мешалки инку- бируют в течение 255 мин при 37 С.

Путем измерения проб надосадочной жидкости суспензии-адсорбента в УФфотометре (280 нм) в различные моменты во время инкубации можно проследить за кинетикой выделения протеина

ФС и таким образом образования ФАБфрагмеятов. По окончании инкубации адсорбент снова загружают в колонку и промывают буфером Б. Для насыщения свободными Н-группами из процесса расщепления папаином в присутствии цистеина адсорбент промывают буфером (75 мМ фосфата, рН = 7,5/О, 15 И хлористого натрия/0,01X гибитана), к которому добавляют 10 мИ иодацетамида. Иодацетамидный буфер оставляют на 2 ч при комнатной температуре в контакте с адсорбентом. Затем с помощью раствора О, 15 моль хлористого

25 натрия/0,013 гибитана вьмывают избыточный иодацетамид и с помощью 30 мИ раствора хлористого натрия подготавливают адсорбент для осуществления элюацяи.

Элюация (при комнатной температуре) .

Для. элюирования специфических

ФАБ-фр а г мент ов ч ер е з кола яку пр опускают 3 мМ водной соляной кислоты.

ФАБ-протеин в стоке из колонны обнаруживают путем измерения УФ-адсорбции (280 нм) и собирают„ S-7 л раствора, содержащего примерно 11 r протеина, концентрируют путем ультрафильтрации до объема 200-250 мл, затем тотчас лиофилизируют.

Гель-проникающая хроматография (4 С).

Колонку длиной 1 м заполняют 7,5 л

45 сефакрила S-200 и уравновешивают буфером (5 мМ фосфата, рН=7,0/0,5 M хлористого натрия/0,002X гибитана) .

Примерно S r ФАБ-лисфилизата растворяют в 110 м уравновешивающего буфера и подают на колонку. Путем регистрации УФ-абсорбции в элюате устанавливают ФАБ-пик с молекулярным весом

50000 и его собирают. Выход примерно

3,75 г гель-хроматографически однородного протеина. Остальные иммуноглобулиновые фракции, высокомолекулярные ФАБ-агрегаты и фракции с меньшим молекулярным весом отделены.

ФАБ-раствор объемом примерно 70014559 средственно после этого промывают

4 л свободного от папаина буферного раствора и ФАБ-фрагменты вымывают

5 ммоль водной уксусной кислоты согласно примеру 4. Результаты соответ5 ствуют результатам примера 1.

Пример 6. Реакцию примера 1 повторяют с той лишь разницей, что хлористый натрий, добавляемый к буферному раствору С, заменяют 0,2 моль карбоната алюминия. Кроме того, гельферментативную хроматографию на сефакриле S-200 заменяют хроматографией на сефадексе 1 25 М (Phaunacia

Fine Chemica1e). В этом случае ре. зультаты также соответствуют результатам примера 1, доказывая, что не адсорбционное средство, а тип расщепления антител оказывает соответствующий эффект. При этом нет также различий, если расщепление проводят не в отдельном сосуде, а непосредственно в колонке.

Пример 7. Повторяют пример 5,25 причем используют натрийфосфатный буфер (0,5 М, pH=7,5) в качестве растворителя для адсорбции и расщепления папаина и в качестве адсорбирующего средства применяют силикагель с удельной поверхностью 1,О м2/г.

Расщепление папаина осуществляют тем, что раствор 240 r папаина в 2 л этого буфера наносят прямо на колонку, причем жидкость течет примерно

30 мин и после этого прерывают ее течение и раствор еще следующие 5 ч оставляют на колонке. Затем промывают с помощью 4 л не содержащего папаина буфера и ФАБ-фрагменты вымыва40 ют с помощью 5 ммоль водной уксусной кислоты согласно .примеру 4б. Результаты соответствуют примеру 1.

Пример 8. Реакцию примера 1 повторяют с тем отклонением, что гель-ферментационную хроматографию осуществляют на геле оксида алюминия с удельной поверхностью 20 м /г.

В растворе фосфатного буфера устанавливают рН=7,0. Также при этом получают результаты, соответствующие примеру 1.

Предлагаемый способ позволяет повысить на 18-20% специфичность

При- Способность к свямер зыванию, мг (дигоФ ксина/мг ФАБ-фрагмента) Эндотокси, ед.

Срав-. нение

12,8

О, 011

О, 013

О, 013

0,012

0,013

О, 014

О, 013

0,22

0 28

0,87.

0,30

4а

0,1

4б

0 50

4в

0,75

О, t3

0 44

0,12

0,70

0,14

0,26

0,15

99 10 антител и значительно повысить степень удаления эндотоксина.

Формула из обр ете ния.

Способ получения дигиталис-антител, включающий иммунизацию мпекопитающих дигоксинбелковым антигеном, выделение гамма-глобулина, расщепление папаином, выделение ФАБ-фрагментов на иммуносорбенте с использованием промывки и элюации, гель-фильтрации и ионнообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности антител и степени очистки от эндотоксинов, что антитела адсорбируют на иммуносорбенте, состоящем из пористого стекла, или силикагеле, или окиси алюминия с объемом пор 1-20 м2/г, в котором через этоксилилпропиламин связан дигитоксинальдегид, антитела расщепляют на адсорбенте, промывку осуществляют буферным раствором с рН 6,0-7,5 и антитела элюируют вод-.. ной кислотой.