Способ идентификации генотипов сорго
Изобретение относится к биотехнологии и может применяться в селекционно-генетических исследованиях. Целью изобретения является повышение точности анализа. Способ состоит в том, что кафирин экстрагируют изопропанолом после удаления дистиллированной водой танинов, проводят разделение в электрическом поле, после чего составляют белковые формулы, сопоставляя белковые спектры относительно реперного компонента В<SB POS="POST">50</SB>. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4621242/30-13 (22) 19.12.88 (46) 07.11.90. Бюл. N 41 (71) Казахский научно-исследовательский институт земледелия им. В.P.Âèëüÿìñà (72) Ю.В.Перуанский и И.М.Савич (53) 631.522.58.083.5 (088.8) (56) Taylor J,R.N.et al. Sorgum cultivar . vatification by е!естгорпогез1з. — J.Sci. Food
Agric., 1984, 35, р. 1. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ СОРГО. Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству, а именно к селекции и семеноводству, и может быть использовано научными учреждениями при создании и паспортизации линий, сортов и гибридов сорго.
Целью изобретения является увеличение точности анализа.
Способ состоит в том, что экстракция кафирина проводится после удаления иэ муки зерна сорго танинов (полифенолов) дистиллированной водой; иэопропанолом или этим растворителем, содержащим мочевину при нагревании, электрофорез или изоэлектрофокусирование белков осуществляется в пластинчатом полиакриламидном геле с последующим проявлением кафириновых компонентов трихлоруксусной кислотой и окраской кумасси R-250, определением относительной мобильности каждого из компонентов, составлением белковых (кафириновых) формул линий: сортов, гибридов сорго.
Пример 1. Зерна сорго размалывают до тонкого порошка, отвешивают 600 мг, заливают 45 мл холодной дистиллирован >
ЯХ 1604273 А1 (я)з А 01 Н 1/06/ G 01 N 33/68 (57) Изобретение. относится к биотехнологии и может применяться в селекционно-генетических исследованиях. Целью изобретения является повышение точности анализа, Способ состоит в том, что кафирин экстрагируют изопропанолом после удаления дистиллированной водой танинов, проводят разделение в электрическом поле, после чего составляют белковые формулы, сопоставляя белковые спектры относительно реперного компонента BM. 1 з,п, ф-лы, 2 табл.
ЪФ ной водой и выдерживают при 4 С в течение
30 мин. Центрифугируют при 8000 g в течение 15 мин, воду сливают, а осадок заливают
2 мл 70 -ного изопропанола, перемешивают и помещают в водяную баню на 1 ч при
60 С. После центрифугированиия при 8000 g в течение 15 мин супернатант упаривают досуха под феном и растворяют в 100 мкл . 8 М мочевины, содержащей 20% сахарозы, 5 2-меркаптоэтанола и 0,6% уксусной кислоты. Раствор белка нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин и наносят в
"карман" геля 40 — 50 мкл.
Электрофореэ проводят в пластинчатом геле размером 110х110х1 мм, содержащем, %: акриламид 10; метиленбисакриламид
0,2; уксусная кислота 2; ТЕМЕД 0,3; глицин
0,1; мочевина 8 М; аскорбиновая кислота
0,05; сернокислое закисное железо 0,001; персульфат аммония 0,025. Электродный буфер содержит 0,4% уксусной кислоты и
0,04 глиоина. Электрофорез ведут 30 мин при напряжении 250 В, а затем 3,5 ч при напряжении 500 В. После окончания электрофореза гели фиксируют в течение 30 мин в 10%-ном растворе трихлоруксусной кис1604273 лоты, а затем окрашивают 0,001%-ным раствором кумасси R-250 в течение 1,5 — 2,0 ч при постоянном перемешивании, За репер принимают наиболее интенсивный компонент в средней части геля (Вщ) и путем измерения расстояния от старта до положения каждого белкового компонента вычисляют подвижность (ОЭП). Компоненты группируют по подвижности; А — субфракция от О до 41,  — субфракция от 42 до 54, С— . субфракция от 55 до 65 и D — субфракция от
66 до 100, и составляют белковые (кафириновые) формулы для каждого генотипа (по данным электрофореза), приведенные в табл.1.
Пример 2. Зерна сорго размалывают до тонкого порошка, отвешивают 200 мг му-, ки, заливают 15 мл холодной дистиллированной воды и оставляют при 4 С на 30 мин, центрифугируют при 8000 g в течение
15 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а к осадку добавляют 2 мл 70%-ного изопропанола, содержащего 4 M мочевины, перемешивают и оставляют стоять на 30 мин при комнатной температуре, затем 1 ч — при 60 С на водяной бане. Проводят центрифугирование взвеси при 8000 g 15 мин.
Надосадочную жидкость сливают, упаривают под феном до 1/8 — 1/10 первоначального объема и наносят на гель для изоэлектрофокусирования (ИЭФ) в объеме
30- 35 мкл на дорожку, На одну из дорожек наносят смесь белков — маркеров с известными ИЭТ. ИЭФ проводят в пластинках геля размером 240х110х0,5 мм, содержащего, %: акриламид.5; метиленбисакриламид
0,27; ТЕМЕД 0,045; персульфат аммония
0,36; амфолит — носитель с интервалом рН 4—
92; мочевина 7М при 12 С. Режим ИЭФ:
15 мин 200 В, 15 мин 400 В, 15 мин 800 В, 45 мин 2400 В. После окончания ИЭФ гели фиксируют в 10 -ном растворе ТХУ, содержащем 3,5% сульфосалициловой кислоты, в течение 30 мин, промывают 30 мин 10%ным раствором ТХУ и окрашивают при постоянном перемешивании 0,001%-ным кумаси R-250.
ИЭТ разделившихся компонентов находят по калибровочной кривой, построенной с учетом положений белков-маркеров с известными ИЭТ. Компоненты кафирина груп5 пируют в соответствии с их ИЭТ: а-субфракция от 3,5 до 6,5; Р-субфракция от
6,6 до 8,0; у-субфракция от 8,1 до 9,5, и составляют специфические белковые (кафириновые) формулы для каждого, генотипа
10 (по данным ИЭФ), приведенные в табл.2.
Белковая (кафириновая) формула характеризует каждую линию, сорт или гибрид сорго. На ее основе паспортные данные (цифровые) образца можно хранить в памя15 ти ЭВМ, Предлагаемый способ идентификации генотипов сорго отличается объективностью, надежностью, быстротой при распознавании сортов, линий, гибридов сорго. Белковые фор20 мулы можно хранить в памяти ЭВМ, Формула изобретения
1. Способ идейтификации генотипов
25 сорго, включающий экстракцию проламинов из размолотых зерен, их разделение в электрическом поле и анализ полученных белковых спектров, отличающийся тем, что, с целью увеличения точности ана30 лиза, кафирин экстрагируют после удаления дистиллированной водой танинов изопропанолом при нагревании с дальнейшим восстановлением дисульфидных связей, белковые спектры анализируют путем опре35 деления электрофоретической подвижности каждого компонента и группировки их в соответствии с их мобильностью относительно реперного компонента Вщ с дальнейшим составлением белковых формул.
40 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при изоэлектрофокусировании экстракцию кафирина производят изопропанолом, содержащим мочевину, без восстановления дисульфидных связей, при
45 этом белковый спектр анализируют путем определения изоэлектрических точек компонентов по маркерным белкам.
1б04273
1604273
CO
CO
LA
СЧ
CO
- СО со со о
СЧ
00 л
CO
LA
ИЪ
СЧ
LA
CV
CO
00 о
СО л
° %»
1Я
v
ЪС . I»
Щ
1D о
CL
C) ч- 00
00 00
О)
С Ъ 1ЦЪ у
1 ССЪ
СЧ 1.
1»
ID
ССЪ LA
С0 о
Ф
ЯО 1 СО (О
IA 1СЪ
Л СЪОЪ
СО 1 Л
СЧ N
LA CO
IA Q)
Сб LA
Cb
С Ъ 1 .
Сс
Сь, СЧ
LD 1, С-: LA
СО
СЧ .
С»»
LD
LA ID
00 1».
CO
СО Л
CO
LA
t С Ъ
Я С» оъ
ОЪ LA
CI CO
ID LA Ф С
W LA
° 1 СО
С„LA
ct LA
ID
IA
СЪЭ M С Ъ
С6 ССЪ CO
ID а- ю»
С Ъ LA CO
LA
С Ъ
С о
СЧ СО
Л оъ
СЧ t1 иЪ
СО "Ъ
00 СО 1О
lA
0С1 t
CO
С..ф юл
LA оъ С Ъ ,Ъ... CO
LA
° 1 CO сч о .
„,: LA
LA W
С Ъ IA
Ф о с о о
С1 о
6)
З х
Ф о
М о
Щ
1о х
Щ
6)
С0
М оъ
СЪ ССЪ Г=
СЧ фь. ЦЪ л
С.- иЪ
СО
В 1" юо
° Ф
00 С, (О
МЪ Ф- СЪ
Юt
С Ъ
LA
CO л
ID о
LA +?
C) С»
LA
ОЪ CO
С"Ъ ID
LA ID
09 ID 3
Ct
v
Б
Ф о
v во
С Ъ 0
1»» о) СЪ"
C) 1- ССЧ 1"
t lA
CO CO
LA
Ю МЪ
lA
СО 1».
Ю о г- о
CO(О t
СЧ С Ъ
lA <О
lA . С Ъ .СО и о с о й. о х
ID
i- Cb
00 СО ов
С Ъ
1»
СЧ
LA t
t LA
CO
СЧ о>
t lA
LD и)ло
С0 ео ID
00 с„, О) О
LA
Р С9 СЪ)
ССЪ С Р
IA
Ю
CO 0 оъ Ъ иЪ
СЧ Г.СР IA
О СО ct LA
Ю 04
Сб СО
ID С9 LA
