Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus. мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к гликопротеину е /v 3/ вируса клещевого энцефалита

 

Изобретение относится к гибридомной технологии и может быть использовано для аффинной очистки гликопротеина E(V3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Цель изобретения - получение штамма гибридомы, продуцирующей низкоавидные моноклональные антитела (монАТ) к ВКЭ. Штамм получают гибридизацией клеток миеломы X63.AG8.653 с клетками селезенки мышей BALB/C, иммунизированных очищенным антигеном. Штамм культивируют в суспензионно-монослойной культуре в среде RPM I 1640 с 15% сыворотки эмбриона коровы, 2 MML - глутамина, 50 мкг/мм гентамицина, а также в брюшной полости сингенных мышей. Специфичность монАТ определяют методом твердофазного иммуноферментного анализа на том же антигене. Кроме того, монАТ активны в реакции торможения гемагглютинации. МонАТ не выявляются в реакциях связывания комплемента, преципитации в агаре и нейтрализации. Константа связывания с дрЕ равна 6,4 <SP POS="POST">.</SP> 10<SP POS="POST">-6</SP> М. МонАТ принадлежит к классу 1 GGI. Штамм депонирован под номером ВСКК(П) N282D.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦЕЛИСТЬНЕСНИХ

РЕаЪБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР (21) 4674770/13 (22) 10. 04. 89 (46) 30.07.91. Бюп. Р 28 (71) Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов АИН СССР и Институт иммунологии (72) С.Н.Атанадзе, В.И.Новиков, С.Г.Рубин, И.В.Красильников, И.А.Николаева и И.Г.Сидорович (53) 678.085.23(088.8) (56) Heing F.Х., Berger R., Najdic О ° е.а. — Infect..lrmnunol., 1982, 37, 784 — 869. (54) ИТАМИ ГИБРИПНЫХ КУЛЬТИВИРУЕгЯХ

КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ NUS. MUSCULUS L.

ПРОДУЦЕНТ ИОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К

П1ИКОПРОТЕИНУ Е (V 3) ВИРУСА КЛЕЩЕВО"

Ю ЭНЦЕФАЛИТА (57) Изобретение относится к гибри= домной технологии и может быть использовано для аффинной очистки гликопротеина Е (V 3) вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Цель изобретения

Изобретение относится к гибридом= ной технологии и может быть исполь= зовано для аффинной очистки глико= протеина Е (v3) вируса клещевого энцефалита (ВКЗ).

Цель изобретения †. получение штамма гибридомы, продуцирующей низ= коавидные моноклональные антитела монАТ к ВКЭ.

Штамм 1 ВСКК (II) 283 В получают следумцим образом.

Клетки миеломы Р3.Х63,Ая8.653 сливают со спленоцитамн мышей линии

„„ЯУ„„1666531 А 1 (g))S С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08

2 получение штапика гибридомы, продуцирующей низкоавидные моноклональные антитела (монАТ) к ВКЗ. Штамм полу= чают гибридизацией клеток миеломы

Х63.Ag8.653 с клетками селезенки мы= шей Ва1Ь/с, иммунизированных очищен ным антигеном. Штамм культивируют в суспензионно.-монослойной культуре в среде RPM I 1640 с 157. сыворотки эмбриона коровы, 2 mM L-глутамина, 50 мкг/мм гентамицина,а также в брюш ной полости сингенных мьппей. Специ-. фичность монАТ определяют методом твердофазного иммуноферментнаго ана= лиза на том же антигене. Кроме того, MoFIAT активны в реакции торможения гемагглютинации. ИонАТ не выявляются в реакциях связывания комплемента, преципитации в arape и нейтрализации.

Константа связывания с дрЕ равна

6,4 10 6N. МонАТ принадлежат к клас= су JgG1. Штамм депонирован под номе.— ром ВСКК(П) Ф 282 О.

Balb/ñ, иммомунпзированных гликопротеином Е вируса КЭ западного типа (штамм 256). Иммунизацию мышей прово= дят 4-кратно с недельными интервалами (первичная иммунизация 5 мкг белка с полным адьювантом Фрейнда внутрибрнкшинно, последующие †. те же дозы белка на физиологическом растворе)„

Сливающим агентом служит 50 =ный раствор полизтиленгликоля (ПЗГ) с мо лекулярной массой 6000. К осадку кле= ток, содержащему 10 ° 10 клеток млеломы и 10 10 клеток селезенки мьш ей, 1666531 выделенных на 4 сутки после последней иммунизации белком Е, добавляют 1 мл

50Х-ного раствора ПЭГа. После легкого перемешивания в течение 1 мин к клет. кам с ПЭГом добавляют обычную культу= ральную среду без сыворотки, доводя конечный объем до 10 мп в течение

5 мин при постоянном перемешивании. ,Затем клетки отмывают низкоскорост-. ным центрифугированием в течекче (, 5 мин.

Осадок разводят средой для культивирования гибридом, содержащей гипок сантинаминоптеринтимидин (ГАТ), и разливают в 96-луночные панели, куда накануне засевают перитонеальные макрофаги и тимоциты (1-5 ° 10 макро-., фагов и 1 ° 10 тимоцнтов на панель) синг енных мышей.

Z0

Через 8-12 сут инкубирования в атмосфере с 5-.7/ углекислого газа при

37 С определяют количество образую щнхся колоний гибридомных клеток.

Посредством твердофазного иммунофер= ментного анализа оценивают число ко-. лоний секретирующих антитела к глико= протеину Е вируса КЭ. Клетки из лунок, в супернатанте которых обнаруживают синтез специфических антител, подво гают .клонированию. Последнее проводят в 96=луночных панелях методом предельных разведений (50,5 и 0,5 кле= ток на лунку). для последующих рекяо ннрований отбирают лунки, в которых обнаруживается синтез специфических антител, при наличии в них не более

1-2 колоний. Всего проводят 5 реклойи рований, после чего полученный штамм переводят в массовую культуру †. вна-. 1 чале в количестве 2 10 клеток в

10 мн среды, а затем 4 10 клеток в

25 мп среды. штамм характеризуется следунартми свойствами.

При оптимальных условиях культиви рования жизнеспособность клеток равна

95-987. Время удвоения, определяемое путем прямого подсчета количества кпеток в суспензии, меняется в зави= симости от условий культивирования B диапазоне 20-. 40 ч„ За период 23 дня после посева клетки претерпевают 12 деления и достигают плотности

6-8.10 клеток в 1 мл. В культурах с

f 55 более высокой плотностью отмечается ! повышенная гибель клеток „Кратность рассева равна 1+2 — 1+3„

Клетки штамма после четырех рекло= нирований переводят с селективной среды с добавлением ГАТ на обычную среду следующего состава: среда

RPNI-1640 с 15 фетальной телячьей сыворотки и 2 мМ 1-глютамина. Для исключения возможности бактериально-. го пророста в среду добавляют гента-. мицин в дозе 50 мкг/мп.

Гибридома по типу роста является суспензионной культурой и растет в виде гроздей из 10=30 клеток и в ви-. де единичных клеток, Характер роста меняется в зависимости от качества используемого пластика или стекла.

Пересев культуры осуществляют путем знергичного встряхивания культураль ного сосуда или смывом клеток с культуральной поверхности средой под давлением из шприца в случае роста культуры в виде монослоя. Морфология кпеток предлагаемого штамма =клетки неоднородны по форме и размерам, но преимущественно имеют округлую форму и неровные края.

При внутрибрюшинной транспланта.ции 1- 5-106 клеток гибридомы син-. генным мьппам, получившим предвари= тельно за 2О-30 сут внутрибрюшинно по 0,3 мп пристана, отмечается рост опухоли в асцитной форме через 8=

15 сут, От 1 мыши получают от 1 до

6 мл асцитной жидкости.

Культура клеток штамма не конта-. минирована грибами, бактериями, ви= русами и микоплазмами.

Криоконсервирование клеток гиб= ридомы проводят на среде, состоящей из 903 фетальной телячьей сыворотки и 107. диметилсульфоксида.

Гибридома продуцирует монАт к ос новному функциональному белку оболоч-. ки вируса КЭ = к гликопротеину Е.

Антитела относятся к подклассу IgG1.

Титр антител по данным иммунофер= ментного анализа в культуральной жид кости ранен 12 10, а в асцитной

C жидкости 1 10 — 1-10 . Антитела не

9 выявляются и реакциях связывания комплемента, диффузионной преципита ди в агаре и нейтрализации. В то же время они активны в реакции тормо.жения гемагглютинации (титр 1/160).

Активность антител низкая — констан та связывания равна 6,4 10 И

Пример. Выделение белка E вируса КЭ методом аффинной хромато15

Формула изобретения

1 1тамм гибридных культивируемых кпеток животных Nus. musculus L.

BCKK(II) N- 283D — продуцент монокло нальных антител к гликопротеину Е (v.3) вируса клещевого энцефалита.

Составитель Г.Игнатьева

Техред М.Моргентал Корректор M.Äåì÷èê

Редактор Н.Киштулинец

Заказ 2498 Тираж 378 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина, 101

5 166653 графии с применением монАТ, выраба тываемых гибридомой.

МонАТ получают, трансплантируя внутрибрюшинно по 1-5 10 клеток предлагаемого штамма гибридомы син" генным мышам, получившим предвари.тельно за 20-30 сут внутрибрюшинно по 0,3 мп пристана, Рост опухоли от= мечают в асцнтной форме через 8=

15 сут. Объем асцитной жидкости, получаемой от 1 мьппи, колеблется в пределах 1=6 мп. Титры монАТ к глико протеину Е в асцитной жидкости по данным иммуноферментного анализа равны 1 10 < - 1 10 .

Для аффинной хроматографии колон= ки размером 1х5 см заполняют макро= пористым стеклом, модифицированным либо поликлональными антителами к 20 вирусу КЭ, либо монАТ, секретируемыми предлагаемым штаммом.

На каждую из колонок наносят сус= пензию, содержащую гликопротеин E вируса КЭ в количестве 5 мг. После 25 адсорбции белка колонки промывают

0,1 М фосфатно-солевым буферным раст= вором и элюируют белок Е 0,1 N трис=

HCl буфером, рН 8,5 с градиентом хлористого натрия, а затем - тем же 30 буфером с градиентом тиоцианата ка лия а

Из колонки с сорбентом, модифици= рованным поликлональными авидными антителами, при использовании гра-.

35 диента хлористого натрия белок Е не элюируется. При использовании в ка= честве элюярующего агента М тиоциана= та калия выход белка на этой колонке составил ЗОХ от нанесенного на колон 4О ку количества белка, а его специфи= ческая активность 10X„

Из колонки с сорбентом, модифицированным монАТ, секретируемыми предла=

1 о гаемым штаммом, выход белка E состав ляет 707. при использовании в,качест ве элюирующей жидкости вьппеназва н ного буфера с 0,6 М хлористого нат рия. При этом специфическая актив-. ность полученного белка полностью со храняется.

Благодаря низкой авидности анти тел при использовании их в аффинной хроматографии можно применять щадящие воздействия для разрыва связи анти-. тело = антиген, что позволяет избежать денатурации антигена и обеспечивает его высокий выход.

Так, выход антигена (белок Е виру са КЭ) при аффинной хроматографии с использованием авидных антител, со= ставляет 307, а применение низкоавид= ных монАТ, секретируемых полученной гибридомой, позволяет повысить выход антигена до 707.. При этом удается получить примерно в 7 раз больше анти гена, сохранившего свои серологи ческие свойства (из колонки с сдр бентом, модифицированным авидными антителами, отмечается выход 10Х белка Е, сохранившего активность в серологических реакциях, от количества белка, нанесенного на колонку, выход белка Е, сохраняющего активность в серологических реакциях, из колонки с макропористым стеклом, модифици-. рованным монАТ, вырабатываемыми полученной гибридомой, составляет 70K).