Способ получения препарата из гипофизов животных для вызывания полиовуляции
Изобретение относится к сельскому хозяйству , а именно к эндокринологии животных , и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию, а также в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей. Цель изобретения - снижение трудоемкости способа и исключение токсичных веществ. Для этого используют высокомолекулярный полиспецифический ингибитор из Изобретение относится к сельскому хозяйству , а именно к эндокринологии животных, и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию , а также в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей. Цель изобретения - снижение трудоемкости способа, исключение токсичных веществ . соевых бобов в количестве 1 г на 1 кг железы; CaCI t до концентрации в среде 0,2 мМ и 2 М NaOH для формирования требуемых ионного состава, ионной силы и рН среды до 9,5 в целях создания оптимальных условий экстракции; используют ортофосфорную кислоту в смеси с другой минеральной или органической, например уксусной, кислотой для доведения рН среды до 3,5 и первичного фракционирования сульфатом аммония с последующим двукратным осаждением возрастающими концентрациями соли, растворением второго осадка, его диализом и лиофилизацией. Использование ингибитора из соевых бобов предотвращает губительное действие протеолиза на биологически активное начало препарата, исключается .из технологии применение токсичных и канцерогенных реагентов, каковыми являются синтетические ингибиторы протеаз. Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия и смеси ортофосфорной с другой органической или минеральной кислотой приводит к упрощению способа и сокращению времени получения препарата без снижения его биологической активности. 3 табл. Замороженные гипофизы измельчаются на холоде в среде с концентрацией СаС12 0,05 мМ и ингибитором протеаз из соевых бобов 0,5 г на 1 кг железы, рН доводится 2н. NaOH до 8,0. Экстракция гипофизов осуществляется в этой же среде (1:2,0j масса/обьем) при температуре 2-4°С, с перемешиванием продолжительностью 2 ч. По истечении этого времени осаждаются в рефрежираторной центрифуге (4°С, 10000 д. W Ё ч4 2 N4 00 Os
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 А 61 К 37/32
ГОСУДАРСТВЕН(ЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4761852/15 (22) 25.10.89 (46) 15,01.92. Бюл. М 2 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных (72) В.А.Галочкин, В.П.Галочкина, К.И,Бахитов и А.Г.Логинов (53) 612.432/434:615,4 (088.8) (56) О,Т.Armstrong, M.À.Opavsky. Biology of
Reproduction (1988), ч.39, N. 3, р. 511-518.
Stellman S.Z. and Pokley F.M.
Endocrinology (1953), ч.53, р. 604. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИЗ
ГИПОФИЗОВ ЖИВОТНЫХ ДЛЯ Bbl3blBAНИЯ ПОЛИОВУЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к зндокринологии животных, и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию, а также в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей. Цель изобретения — снижение трудоемкости способа и исключение токсичных веществ, Для этого используют высокомолекулярный полиспецифический ингибитор иэ
Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к зндокринологии животных, и может быть использовано на предприятиях по производству препаратов, вызывающих полиовуляцию, à i зкже в научно-исследовательских учреждениях и отдельных лабораториях для исследовательских целей.
Цель изобретения — снижение трудоемкости способа, исключение токсичных веществ, „„Я2 „„1 704786 А1 соевых бобов в количестве 1 .г на 1 кг железы; CaCIz до концентрации в среде 0,2 мМ и
2 М NaOH для формирования требуемых ионного состава. ионной силы и рН среды до 9,5 в целях создания оптимальных условий экстракции; используют ортофосфорную кислоту в смеси с другой минеральной или органической, например уксусной, кислотой для доведения рН среды до 3,5 и первичного фракционирования сульфатом аммония с последующим двукратным осаждением возрастающими концентрациями соли, растворением второго осадка, его диализом и лиофилизацией. Использование ингибитора из соевых бобов предотвращает губительное действие протеолиза на биологически активное начало препарата, исклю- ® чается . из технологии применение токсичных и канцерогенных реагентов, каковыми являются синтетические ингибиторы протеаэ. Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия и смеси ортофосфорной с другой органической или минеральной кислотой приводит к упрощению способа и сокращению времени получения препарата без снижения его биологической активности. 3 табл.
Замороженные гипофизы измельчаются на холоде в среде с концентрацией CaClz
0,05 мМ и ингибитором протеаэ из соевых бобов 0,5 г на 1 кг железы, рН доводится 2н.
NaOH до 8,0. Экстракция гипофиэов осуществляется в этой же среде (1:2,0 масса/обьем) при температуре 2-40С, с перемешиванием продолжительностью 2 ч.
По истечении этого времени осаждаются в рефрежираторной центрифуге (4 С, 10000 g, 1704786
15 мин) нерастворившие я компоненты железы. Надосадочная жидкость сохраняется.
При необходимости можно проводить повторную экстракцию. В этом случае растворимые части объединяются.
8 надосадочную жидкость добавляется (МН jzS04 до концентрации 0,01 M рН доводится до 3,5 холодной смесью приблизительно 10ф,-ной ортофосфорной и приблизительно 207ь-ной другой органической или минеральной кислоты, например уксусной. в соотношении 1,0:0,25. Через 20 мин проводится центрифугирование (при прежнем режиме). рН супернатзнта доводится 2н. NaOH до 6,0 и добавляется сернокислый аммоний до концентрации 1,70 М, оставляется на 2 ч при температуре 2-4 С для формирования осадка. По истечении этого времени смесь центрифугируется (при прежнем режиме). К супернатзнту добавляется сернокислый аммоний до концентрации 2,5 М. рН 6.0 (доводится 2н, NaOH).
Супернатант оставляется при температуре
2-4 С для формирования осадка, центрифугируется при прежнем режиме. Надосадочная жидкость отбрасывается. Осадок растворяется в минимальном количестве
0,2М раствора двухзамещенного фосфорнокислого калия. Раствор диализуется против воды в течение 12 ч при температуре 2-4 С.
Образовавшийся во время диализа осадок отделяется центрифугированием (режим прежний). Прозрачная надосадочная жидкость, содержащая целевой продукт, лиофилизуется известным способом.
Аналогичные этапы выделения целевого продукта проводят по вариантам 2 и 3 на средние значения параметров и варианту 4 на верхние значения параметров (см. табл.1).
Испытана эффективность оптимальногв варианта предлагаемого способа выделения целевого препарата иэ гипофизов животных в сравнении с известным способом. Операции и режимы оптимального варианта приведены в табл.2.
Способ выделения целевого продукта из гипофизов животных(вариант 3) позволяет получать препарат по биологическому теСту на неполовоэрелых крысах, не уступающий препарату, полученному известным способом (см. табл.3).
Таким образом, при выделении целевого продукта замена синтетического ингибитора протеаз бензамидина на поливалентный природный ингибитор соевых бобов позволила исключить иэ технологии токсичный и канцерогенный реактив. В связи с этим предла5
55 гаемый способ исключил процедуры дозированного нагревания с последующим охлаждением и центрифугированием, в случае оптимального варианта снизил время диализа с 72 до 48 ч, Использование хлористого кальция в сочетании с гидратом окиси натрия вместо свежеприготавливаемой гидроокиси кальция исключило необходимость приготовления этого реактива. а также замена свежеприготавливаемой метафосфорной кислоты на смесь фосфорной с другой органической или минеральной кислотой, например уксусной, исключала необходимость приготовления метафосфорной кислоты, при изготовлении которой происходит выделение вредных продуктов, что приводит к исключению иэ технологии токсичных продуктов, упрощению метода, сокращению его по времени беэ снижения биологической активности, Формула изобретения
Способ получения препарата иэ гипофиэов животных для вызывания йолиовуляции, включающий иэмельчение, двукратную экстракцию в щелочной среде, содержащий ингибитор протеаз, центрифугирование при
4 С, 10000g, в течение 15 мин, отделение и объединение надосадочных жидкостей, однократное осаждение сернокислым аммонием в кислой среде при рН 3,5, а затем двукратное при рН 6,0-8,0, центрифугирование, отделение и растворение осадка в
0,2М двухзамещенном фосфорнокислом калии, диалиэ раствора, центрифугирование и лиофилизацию, отл и ч а ющи йс я тем, что, с целью снижения трудоемкости способа и исключения токсичных веществ,в качестве ингибитора протеаэ в среде экстракции используют природный высокомолекулярный полиспецифический ингибитор иэ соевых бобов в количестве 0,5-1,5 г на 1 кг ткани железы с добавлением хлористого кальция до концентрации 0,05-0,3 мМ и гидрата окиси натрия до рН 8,0-9,5, а при осаждении сернокислым аммонием рН доводят до 3 5 смесью 10ф,-ной ортофосфорной и 20ф>-ной уксусной кислот, взятых в соотношении 1:0,25-2,0, причем насыщают надосадочную жидкость сернокислым аммонием до 0,01-0.30 м, выдерживают в течение 20-50 мин, а после повторного и третьего осаждения сернокислым аммонием выдерживают 1-24 ч и диалиэ раствора проводят в течение 12-72 ч вслед эа растворением осадка в двухэамещенном фосфорнокислом калии с последующей лиофилизацией отдиалиэованного раствора препарата.
1704786
Т а б л и ц а 1
° »
Операции
Варианты способа.,Этап
На холоде
Иэмельчение
1:2,0 1:2)5 1:3,0 1:4,0
0,75 1
0,5
1,5
005 015 020 030
6,0 8,5 9,0 9,5
2,0 2,5 3,0 4 5, рН
Время, ч
4 С, 10000, 15 w
1:1,5 1:2,0 1:2,0 1;2 5
hp6 NHHA
0,30
0,10 0,20
0,01
1:05 1:1
30 40
50 прежний время, ч прежний
Экстракция: соотношение ткани, и среды
Содержание ин г ибитора г/кг ткани
СаС1> до концентрации, мМ
Центрифугирование (температура, g, время) Повторная экстракция преципитата в прежней среде: соотношение ткани и среды
Центрифугирование, режим
В объединенную надоса дочную жидкость добавляют сухой (NH«) 10«-ной ортофосфорной и 201-ной уксусной кис° лот, до рН 3,5, соотношение время, мин Центрифугирование, режим В надосадочную жидкость вносят сухой (NH«Q SO« до конечной концентрации, Н Кентрифугирование, режим 1 1: 0,25 1 7 6,0 1,75 6,5 1,3 7,5 1,35 8,0 1704786 Продолжение.табл. 1 1 j 1 Г 1 2 «ю Ей ав авве 10 рН время, ч Центрифугирование, режим прежний ю. объем минимальный ю Осадок растворяют в 0,2И К НРО Диализ против воды, время, ч 24 14 Центрифугирование, режим прежний " Лиофилизация;надосадочной жидкости йзвестным способом ее«ее! П р и м е ч а н и е. Все процедуры проводятся при температуре 2-4 С. Наивысшая активность препарата flo биологическому тесту вариант 3 (табл.3). Таблица 2 ееевеаеюееваeеаееевае Способ Этап Операции аваев«а«аюе евю ееаеаааевеаааее известный предлагаемый на холоде Иэмельчение а холоде Экс тра кция: соотношение ткани и среды 1:4 1:3 свежеприготавливаемый Са(ОН)в 103 ингибитор а) бензамидин, мМ 5,0 б) соевый, г/кг ткани железы 1i0 0,20 до рН 9,0 3,0 3,0 4 С, 10000, 15 мин В надосадочную жидкость добавляют сухой (NH ) 2н. NaOH время, ч центрифугирование, (температура, g, время) 215 6,0 2,3 6,5 3,0 7,5 8 0 1704786 Прололжение табл 2 Г 3 1 4 Вторичная экстракция преципитата (среда прежняя) допустима допустима соотношение ткани и среды 1:3 1:3 2,0 1е2 время, ч прежний прежний 8 обьединенную надосадочную мидкость вводят сухой (NH 4) 504„ концентрация, M до рН 3,5 доводят: 0,15 40 время, мин прежний прежний В надосадочную жидкость вносят сухой (НН4) 804 до конечной концентрации, Н 1,8 7,5 24 рн время, ч прежний прежний 8 надосадочную жидкость вносят сухой (NH 4) S04 до коне ч ной концентрации, M 3,0 7,5 24 рН в ремя, ч прежний прежний обьем ми- минимальный нимальный Термообработка, температура, C 2-3 охлаждение Цент рифугирование, режим Центрифугирование, режим Центрифугирование, режим Центрифугирование, режим А Растворение осадка в 0,2М KXHP04 время, мин охлаждение до 4 С 4 свежеприготавливаемой метафосфорной кислотой, 0,20,5Н не более 40 0,20 смесью 103-ной ортофосборной и 20ь-ной уксусной кислотой (1 ° 1) 1,8 7,5 3 0 7,5 12 Прополл;ение табл.1 1704786 14 центрифугирование, режим прежний прежний Диализ раствора против воды, и Центрифугирование, режим 72 16 прежний прежний известный известный 17 Лиофилиэация, способ П р и м е ч а н и е. Все продукты ведут при температуре 2-4 С, конечный продукт представляет собой лиофилизованный препарат. ТаблицаЗ Составитель А.Филиппова Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор М,Максимишинец Редактор Т.Смирнова Заказ 143 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 Активность препаратов. приготовленных по известному и различным вариантам предлагаемого способа
