Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus, продуцирующий моноклональные антитела к группоспецифическому антигену n системы mnss эритроцитов человека
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена N в эритроцитах человека. Целью изобретения является создание нового штамма гибридных клеток животных Mus musculus. секретирующего моноклональные антитела (МКА), специфически выявляющие N-энтиген в эритроцитах и слабо реагирующие с эритроцитами, не имеющими этого антигена . Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-ХбЗ-А.8.653 с клетками селезенки мышей линии, BALB/c, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON, под воздействием полиэтилен гликоля М.В.3000 и дальнейшего культивирования в селективной среде ГАТ. Соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1,:3. Секретируемые МКА в культуральной жидкости достигают титра 1:256 - 1:512, в асцитной жидкости 1:12800-1:25600; Штамм обозначен N-89/4 и депонирован под номером BCKK0I) Ж62Д. МКА могут быть использованы для выявления N-антигена в эритроцитах . 2 табл. Штамм перевиваемых гибридных клеток N-89/4 получают в результате слияния мышиной миеломы Р3-Х63-Ад.8.653 с клетками селезенки мышей линии ВАШ/с, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа ON, под воздействием полиэтиленгликоля м.в. 3000 и дальнейшем культивировании в селективной среде ГАТ. При слиянии соотношение миеломных клеток и спленоцитов составляет ,1:3. После слияния клетки культивируют в 96-л у ночных платах из расчета 2х105спленоцитов/ячейку 96сл с ч - N VJ
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
° м лм ми
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4824863/13 (22) 11.05.90 (46) 07.03.92, Бюл. ¹ 9 (71) Всесоюзный гематологический научный центр (72) Е.И.Дерюгина, Е.В.Белкина, Л.H,Ëeìå-. нева, Н.И.Оловникова, Н.В.Проскурина, Г.А.Удалов и И.Л.Чертков (53) 578.085.23(088.8) (56) Fraser R.H.. Munro А.С., Williamson АЯ.
et al. Mouse monoclonal anti - N. Prodactlon
and characterization. "F. Immunogenetics".
1982. v 9, р. 295-301.
Дерюгина Е.И.. Дризе Н.И.. Леменева
Л.H. и др. Моноклональные антитела и с анти,N специфичностью. — Судебно-медицинская экспертиза. 1990, т. ЗЗ,Ф1, с. 35-37, Авторское свидетельство СССР
N -1551739. 1988. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕM6fX КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS
MUSCULUS, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ МОНОКЛОНАЛ Ь НЫ Е АНТИТЕЛА К ГРУППОСПЕ-.
ЦИФИЧЕСКОМУ АНТИГЕНУ N СИСТЕМЫ
МЙЯз ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена И в эритроцитах человека.
Целью изобретения является создание нового штамма гибридных клеток животных
Mus musculus, секретирующего моноклональные антитела (МКА), специфически вйявляющие N антиген в эритроцитах человека и слабо реагирующие с эритроцитами, не имеющими этого антигена. Ы 1717147 А1 (si)s А 61 К 39/395, С 12 N 5/00 (57) Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для выявления группоспецифического антигена N в эритроцитах человека. Целью изобретения является создание нового штамма гибридных клеток животных Mus muscutus. секретирующего моноклональные антитела (МКА), специфически выявляющие N-антиген в эритроцитах и слабо реагирующие с эритроцитами, не имеющими этого антигена. Штамм получают слиянием мышиной миеломы РЗ-Х63-А.8.653 с клетками селезенки мышей линии, BALB/ñ, иммунизированных эритроцитами человека фенотипа
0N. под воздействием полиэтиленгликоля
M.Â.3000 и дальнейшего культивирования в селективной среде ГАТ. Соотношение миеломных клеток и спленоцитов 1;.3, Секретируемые МКА в культуральной жидкости достигают титра 1:256 — 1.:512, в асцитной жидкости 1:12800 — 1:25600; Штамм обозначен N-89/4 и депонирован под номером
ВСКК(! 1) М462Д. МКА могут быть использованы для выявления N-антигена в эритроцитах. 2 табл.
Штамм перевиваемых гибридных клеток N-89/4 получают в результате слияния мышиной миеломы РЗ X63 Ag.8.653 с клет-; ) ° ками селезенки мышей линии ВА В/с, им- а мунизированных эритроцитами человека фенотипа 0N, под воздействием полиэтиленгликоля м.в. 3000 и дальнейшем культивировании в селективной среде ГАТ. При слиянии соотношение миеломных клеток и спленоцитов составляет 1:3. После слияния клетки культивируют в 96-луночных платах из расчета 2к10 спленоцитов/ячейку 961717147 луночной плоскодонной платы. Эффективность гибридизации составляет 87 .
Штамм получают в результате двукратного клонирования методом лимитирующих разведений при 1007 антителообразующих клонов.
Штамм N-89/4 хранится в коллекции перевиваемых клеточных линий под М BCKK (И) N462D и характеризуется следующими
10 признаками
Культуральные характеристики. Суспензионная культура клеток в жидкой среде; пассирование 1:2-1:З.через 2-3 сут; клонирование нэ перитонеальных макрофагах мыши. Среда для культивирования: 15
ДМЕМ, 10 -ной эмбриональной телячьей или оленьей сыворотки, 4 мМ L-глутамина, 2 мМ пирувата натрия, 20 мМ Нерез-буфера, 5к10 M 2-меркаптоэтанола, 5 g ной среды, кондиционированной спленоцитами мыши, 20 антибиотики; 37 С, 67 СО в воздухе. г. Культивирование гибридных клеток в организме животного: мыши линии ВА В/с
25 или их F! гибриды с мышами линий \/Чй или
DBA/2 пристан по 0,25 мл в/бр зэ 7 сут введения клеток по 1-5к10 /мышь. Среднее
6 время роста гибридомы в форме асцитной опухоли 12 сут.
Морфология клеток: штамм представ.30 лен слабо прикрепляющимися к субстрату клетками с обычной для энтителопродуцирующих клеток морфологией.
Видовая принадлежность штамма: доказана цитогенетическим методом, Кариотип соответствует виду Mus musculus.
Число хромосом составляет 83 92, генетические маркеры — 1 метацентрическэя и 1 большая субметэцентрическая хромосомы.
Сведения о контаминации линии: контаминация бактериями, грибами, микоплазмами не обнаружена, вирусы не тестированы.
Характеристика полезного вещества, продуцируемого штаммом:.анти-N антитела, принадлежащие к иммуноглобулинам класса G2b и агглютинирующие эритроциты человека, несущие N антиген. Метод тестирования — агглютинация в солевой среде и на плоскости.
Характеристика полезных продуктов: 50 титр. антител в культурэльной жидкости в реакции солевой агглютимации в круглодонных микроплатах с эритроцитами ON —
1:128-1:256. Титр. антител в асцитной жидкости в реакции агглютинации в микроплате 55
1:12806-1:25600. Стабильность энтителопродукции сохраняется в течение 12 пассажей в культуре.
Криоконсервирование клеток: ростовая среда, 10 g, ДМСО, 407ь любой сыворотки; сутки при -70 С, затем — жидкий азот. Жизнеспособность после размораживания 5565%. После размораживания культивирование ведут в 24-луночных платах по 0,5х10 клеток/ячейку на фидере из перитонеальных макрофагов мыши.
Пример. Активность моноклональных антител в серологических реакциях.
Образцы асцитной жидкости, индуцированной. клетками штамма N-89/4, исследуют общепринятым методом со стандартными эритроцитами в реакции агглютинации на плоскости и в реакции агглютинации в солевой среде в 96-луночных платах. Под титром антител подразумевают такое их последнее разведение, при котором в ячейке наблюдают агрегаты эритроцитов, а на плоскости крупные агглютинаты начинают образовываться на 2-3 мин. Под авидностью подразумевают сродство изучаемых антител к стандартным эритроцитам, оцениваемое в реакции эгглютинэции на плоскости по времени появления первых агглютинэтов (первый параметр), времени наступления четкой реакции эгглютинации (второй параметр) и времени появления крупных агглютинатов (третий параметр).
МКА N-89/4 обладают условной специфичностью, т.е. направлены, по-видимому, к гомопогичной терминальной последовательности N формы гликофорина A(ON эритроциты) и гликофорина B (ON и ОМ эритроциты). Как видно из табл. 1, обработка эритроцитов химотрипсином, к которому чувствителен только гликофорин В, приводит к исчезновению перекрестной активности полученных МКА с эритроцитами OM.
При этом титр. антител по отношению к эритроцитам ON, обработанным химотрипсином, снижается всего нэ одну ступень (одно двойное разведение), поскольку структура гликофоринэ А сохраняется.
Результаты исследования титра (активности) и авидности МКА, секретируемых клетками штамма N-89/4 и направленных против N антигена системы MNSs эритроцитов человека, представлены в табл. 2. В качестве контроля использованы МКА N-86/2.
Таким образом, МКА, секретируемые штаммом N-89/4 в асцитной форме, позволяют путем разведения асцитной жидкости в 200 и выше раэ получать высокоактивный специфичный и стандартный реагент антиN для выявления N антигена в эритроцитах и других клетках человека;
Как видно из табл. 2, разница в титрах
МКА N-86/2 с эритроцитами фенотипа N u
M составляет 4 ступени. а разница в титрах
1717147
Формула изобретения
Таблица 1
Таблица 2
Составитель Е.Дерюгина
Редактор Н.Швыдкая Техред М.Моргентал Корректор Л.Бескид
Закаа 829 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
МКА N-89/4 — 7 ступеней (1 ступень — одно двукратное разведение). Это означает,.что путем соответствующего разведения MKA
N-89/4 возможно создание более активного и специфичного реагента, не дающего пере.крестных реакций с эритроцитами М фенотипа.
Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus ВСКК (ll) М
5 462Д, продуцирующий моноклональные антитела к группоспецифическому антигену N системы MNSs эритроцитов человека.
