Способ определения бензодиазепинов в сыворотке крови и среда инкубации для его осуществления

 

Изобретение относится к области биологии , в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня диазепама в биологических жидкостях. Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга, а также скрининга новых психотропных препаратов и проведения клинико-фарма кологических исследований. Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа измерения уровня бензодиазепинов в сыворотке крови. Способ заключается в предварительной обработке сыворотки крови с помощью этилового спирта без дальнейшего отделения белкового преципитата, смешении ингредиентов инкубационной смеси (в качестве радиоактивного лиганда используется 3H-Ro 15-1788, антагонист бензодиазепиновых рецепторов, инкубационная смесь содержит500 мкМ ГАМК), инкубации , разделении свободного и связанного с рецептором меченого лиганда; просчете радиоактивности связанного меченого лиганда; расчете процента ингибирования и определении диазепара в исследуемом образце с помощью рассчитанного на основе контрольной точки коэффициента. 2 с.п флы, 5 табл сл С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1737338 А1 (я)5 6 01 N 33/50

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ с ! (ь)

Cd .,(л)

lj OO » (21) 4651745/14 (22) 21,11.88 (46) 30.05.92, Бюл. ¹ 20 (71) Всесоюзный научный центр психического здоровья AMH СССР (72) M.Ë.Áåëÿåâà и А,Г,Мухин (53) 612.015(088,8) (56) Патент США № 4239744, кл. 424-1.

Патент США ¹ 4280993, кл. 424-1, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕНЗОДИАЗЕПИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ И СРЕДА ИНКУБАЦИИ ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ (57) Изобретение относится к области био- логии, в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня диазепама в биологических жидкостях. Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга, а также скрининга новых психотропных препаратов и проведения клиниИзобретение относится к биологии, в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня бензодиазепинов в биологических жидкостях.

Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга путем определения в крови и иных биологических жидкостях концентраций бензодиазепинов и других веществ, имеющих сродство к бензодиазепиновым рецепторам, в области клиникофармакологических исследований, например для исследования фармакокинетики лекарственных соединений из класса бензодиазепинов, установления. зависимости эффектов препаратов от уровня активных форм в крови при различных путях ко-фармакологических исследований.

Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа из-. мерения уровня бензодиазепинов в сыворотке крови. Способ заключается в предварительной обработке сыворотки крови с помощью этилового спирта без дальнейшего отделения белкового преципитата, смешении ингредиентов инкубационной смеси (в качестве радиоактивного лиганда используется Н-Ro 15 — 1788, антагонист

3 бензодиазепиновых рецепторов, инкубационная смесь содержит500 мкМ ГАМК), инкубации, разделении свободного и связанного с рецептором меченого лиганда; просчете радиоактивности связанного меченого лиганда; расчете процента ингибирования и определении диазепара в исследуемом образце с помощью рассчитанного на основе контрольной точки коэффициента. 2 с.п, флы, 5 табл, введения; в исследованиях по экспериментальной фармакокинетике; для скрининга новых психотропных препаратов на специфическую биологическую активность.

Целью изобретения является упрощение способа определения уровня бензодиазепино в в крови и увеличение чувствительности среды инкубации.

Цель достигается тем, что предварительную обработку образца сыворотки крови проводят с помощью добавления к образцу этилового спирта (к 20 мкл сыворотки 45 мкл спирта), смесь инкубируют 15 — 20 мин при комнатной температуре, далее без отделения свободного от белков образца добавляют остальные ингредиенты инкубационной смеси; в качестве радиоактивного

1737338

55 лиганда используют Н вЂ” Ro 15 — 1788, антагоз нист бензодиазепиновых рецепторов; для работы используют трис-НСI буфер, содержащий 500 мкМ гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), которая увеличивает сродство бензодиазепиновых рецепторов к агонистам (исследуемый препарат), не изменяя сродство рецепторов к антагонистам (радиоактивный лиганд), Таким образом, достигается преимущество связывания со специфическими местами для исследуемого препарата; расчет концентраций препарата в сыворотке крови производится без построения калибровочной кривой, на основе коэффициента пересчета, определяемого по одной контрольной точке.

Используют концентрацию меченого лиганда, равную 0,3-0,4 нМ в пробе. Выбор ее обусловлен тем, что по теории ингибиторного анализа рецепторного связывания максимальная чувствительность наблюдается при концентрации меченого лиганда в пробе порядка 0,1-0,2 Кд (Кд — равновесная константа диссоциации меченого лиганда), Снижение концентрации ниже этих значений не имеет смысла, т.к. дальнейшего увеличения чувствительности не дает и ведет лишь к снижению счета радиоактивности, что повышает ошибку определения.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирке смешивают сыворотку крови с этиловым спиртом, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре

15-20 мин. После этого добавляют меченый лиганд Н вЂ” Ro 15-1788, рецепторный матез риал, перемешивают и инкубируют при 0 С в течение 50 — 60 мин. Инкубационная смесь содержит 500 мкМ ГАМ К, Далее разделяют свободный и связанный радиоактивный лиганд с помощью фильтрации под вакуумом и просчитывают радиоактивность связанного лиганда на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Концентрацию исследуемого бензодиазепина определяют с помощью рассчитанного коэффициента пересчета, который определяют на основе контрольной точки.

Набор для осуществления способа содержит следующие компоненты: Н-Ro 15— .з

1788, в качестве мембранного препарата рецептора — синаптосомальную фракцию серого вещества коры головного мозга быка, стандартную сыворотку от психически здоровых доноров без диазепама и контрольную сыворотку с концентрацией диазепама 100 нг/мл, 2 мМ раствор немеченого диазепама, навески для приготовления трис — HCI буфера, содержащего ГАМК, и буфера для промывки фильтров.

Пример 1 (по прототипу).

1. Материалы и методы.

Рецепторный материал: серое вещество коры больших полушарий мозга быка гомогенизируют в 50 объемах 0,32 М сахарозы, гомогенат центрифугируют при

1000 х g 15 мин. Супернатант переливают в другую пробирку, а осадок ресуспендируют в 0,32 M сахарозе и центрифугируют в тех же условиях. Объединенные супернатанты центрифугируют при 17000 х g 30 мин. Далее полученный осадок трижды промывают в 100 объемах 50 мМ трис-HCI, буфера, рН

7,4, с помощью ресуспендирования и центрифугирования при 30000 x g 25 мин, Конечный осадок разводят этим же буфером до концентрации 200 мг исх, ткани/мл. Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70 С. Характеристики рецепторного материала: Kd = 4,6 + 0,4 нМ, максимальное число мест связывания 20 +. 1,4 фмоль/мг исходной ткани для Н-диазепама.

Стандарты: для измерения уровня диазепама используют сыворотку крови без диазепама и сыворотки, содержащие известное количество диазепама в диапазоне концентраций от 10 до 2000 нгlмл, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов, Меченый лиганд: Н-диазепам фирмы

"Amersham", 81 Ки/ммоль.

2, Процедура определения, Сыворотку крови разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 5. К 1 мл разведенной сыворотки добавляют 50 мкл перхлорной кислоты, перемешивают и центрифугируют при 1500 х g 15 мин. К 25 мкл супернатанта добавляют 375 мкл дистиллированной воды, 1 мл рецепторного материала, который перед употреблением размораживают, разводят 1: 10 трис- ICI буфеоом, рН 7,4, и гомогенизируют, и 100 мкл Н-диазепама (конечная концентрация в пробе ЗнМ). Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в водяной бане при

0 С в течение 50 — 60 мин. Далее содержимое пробирок фильтруют через стекловолокнистые фильтры G F/В ("Whatm an"), фильтры промывают 2 раза по 5 мл холодным трисHCI буфером и помещают в сцинтилляционные флаконы с сцинтилляцион ной жидкостью. Радиоактивность подсчитывают через 6 — 18 ч.

Расчет концентраций диазепама в исследуемых образцах: для каждой пробы вычисляют процент ингибирования F

SBo/SBi — 1, где SBO — специфическое связывание в образце с сывороткой беэ диазепама, SB — специфическое связывание в исследуемых образцах. Концентрацию диа1737338 зепама определяю- по калибровочной кривой на основе рассчитанного процента ингибирования.

Пример 2 (предлагаемый способ), 1. Материалы и методы.

Рецепторный материал: серое вещество коры больших полушарий мозга быка гомогенизируют в 50 объемах 0,32 М сахарозы, гомогенат центрифугируют при

1000 х g 15 мин. Супернатант переливают в другую пробирку, а осадок ресуспендируют в 0,32 М сахарозе и центрифугируют в тех же условиях. Объединенные супернатанты центрифугируют при 17000 х g 30 мин, Далее полученный осадок трижды промывают в 100 обьемах 50 MM трис-HCI буфера, рН

7,4, с помощью ресуспендирования и центрифугирования при 30000 х g 25 мин, Конечный осадок разводят этим же буфером до концентрации 200 мг исх. ткани/мл. Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70 С. Характеристики рецепторного материала; Kd =4,6 + 0,4 нМ, максимальное число мест связывания 20 +

1,4 фмоль/мг исходной ткани для Н-диазез мапа; Kd = 2,3 + 0,2 нМ, максимальное число мест связывания 31,2 + 1,8 фмоль/мг исходной ткани для Н-Ro 15-1788. з

Стандарты: в работе используют стандартную сыворотку диазепама и контрольную сыворотку, содержащую 100 нг диазепама/мл, Для характеристики способа используют также сыворотки, содержащие известное количество диазепама в диапазоне концентраций от 10 до 2000 нгlмл, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов, Меченый лиганд, Н-Ro 15 — 1788 фирмы

"NeN", 81 Ки/ммоль, Все используемые реагенты (кроме сывороток) готовят на 50 мМ трис-HCI буфере, содержащем 500 мкМ ГАМ К, рН 7,4, 2. Процедура определения.

В стеклянной пробирке объемом 5 мл смешивают 20 мкл сыворотки, не содержащей диазепам, содержащей 100 нг диазепама/мл или калибровочные сыворотки, и 45 мкл этилового спирта 96 (конечная концентрация в инкубационной среде 3 Q. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре

15-20 мин. После этого добавляют 1 мл Н—

Ro 15-1788 (конечная концентрация 0,3-0,4 нМ) и 0,5 мл мембранного препарата рецептора, который перед употреблением размораживают, разводят в 30 раз трис-HCI буфером, содержащим 500 мкМ ГАМК, и гомогенизируют, Содержимое перемешивают и инкубируют в водяной бане при 0 С 50 — 60 мин, По окончании инкубации пробы немедленно фильтруют через GF/B фильтры, Фильтры промывают 2 раза по 5 мл холодным трис-HCI буфером и перемешивают в

5 сцинтилляционные флаконы с сцинтилляционной жидкостью. Радиоактивность проб просчитывают через 6 — 18 ч. Для определения неспецифического связывания в пробирки, содержащие сыворотку без

10 диазепама, вносят по 10 мкл 2 мМ раствора немеченого диазепама до добавления в них

Н вЂ” Ro 15 — 1788.

3, Расчет концентраций диазепама в сыворотках, 15 Для каждой пробы вычисляют величину специфического связывания как разность между пробами, не содержащими и содержащими избыток немеченого диазепама, Для каждой пробы определяют величи20 ну Е ;

F; = SB<>/SB< — 1 где SB — величина специфического связывания в образце с сывороткой без диазепама;

25 SBi — величина специфического связывания в определяемом образце.

Вычисляют коэффициент пересчета К:

К = Fg/100, где Fy — величина F для контрольной сыво30 ротки, 100 — концентрация диазепама в этой сыворотке, нгlмл.

Определяют концентрацию диазепама в исследуемых сыворотках Ci .

35 С, := Fi/К.

Пример 3. Аналогично примеру 2, но в качестве радиоактивного лиганда используют Н-диазепам в концентрации 1,0 нМ в пробе (0,2 Kd).

40 Пример 4. Аналогично примеру 2, в качестве радиоактивного лиганда используют Н-флюнитразепам в концентрации 0,4 нМ в пробе (0,2 Kd), Пример 5. Аналогично примеру 2, но

45 концентрация ГАМК в инкубационной смеси равна 0; 100 кмМ; 1 мМ.

Пример 6. Аналогично примеру 2, но предварительную обработку образца проводят с помощью 15; 30; 75 мкл этанола

50 (конечная концентрация в инкубационной смеси равна 1: 2; 5 соответственно), Пример 7. Аналогично примеру 2, но предварительную обработку образца проводят с помощью 7; 15; 30; 45 мкл метанола

55 (конечная концентрация в инкубационной смеси равна 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 соответственно).

В табл,1 представлены данные по максимальной чувствительности способа (концентрация диазепама, вызывающая

1737338

15%-ное ингибирование специфического связывания Н-лиганда) и по концентрации з полуингибирования специфического связывания меченого лиганда, полученные при проведении анализа известным и предлагаемым способами. Из табл.1 видно, что при проведении анализа предложенным способом (пример 2) чувствительность метода повышается в 3,2 раза по сравнению с прототипом (пример 1). Также отметим, что

50 %ное ингибирование связывания меченого лиганда вызывается концентрацией диазепама в предложенном способе в 5 раз меньшей. чем при проведении анализа по прототипу, В табл, 2 представлены данные о чувствительности метода при использовании различных меченых лигандов, Как следует из таблицы, применение Н-диазепама з ухудшает чувствительность метода в 2,4 раза по сравнению с предлагаемым способом.

При использовании Н-флюнитразепама в з качестве радиоактивного лиганда чувствительность метода в 1,7 раза ниже, чем при использовании Н-Ro 15 — 1788 (предлагаемый способ). Это объясняется тем, что диазепам и флюнитразепам являются агонистами бензодиазепинового рецептора, поэтому в данном случае эффекта ГАМ К не наблюдается, т.е. создается преимуществ для связывания исследуемого вещества, которое также является агонистом рецептора, В табл.3 представлены данные о влиянии различных концентраций ГАМК на чувствительность метода, Так, при анализе в среде, не содержащей ГАМК, чувствительность метода падает в 1,5 раза. При концентрации ГАМК, равной 100 мкМ, чувствительность снижена в 1,4 раза, тогда как при концентрации 1 MM чувствительность практически такая же, как и в предлагаемом методе. Поэтому в целях экономии реактивов в работе используют концентрацию ГАМК 500 мкМ.

В табл.4 представлены данные о влиянии этилового спирта на специфическое связывание. Н-Ro 15-1788, а также об ингибировании чистой сывороткой (без диазепама) и сывороткой с концентрацией диазепама 100 нг/мл (концентрация полуингибирования) специфического связывания меченого лиганда в присутствии различных концентраций этанола, Из табл.

4 следует, что сам эта нол ингибирует связывание Н-Ro 15 — 1788 с дозозависимым эффектом. Однако при этом также необходимо отметить, что по мере возрастания концентрации этанола в инкубационной среде специфического связывания Н-Ro 15-1788 з

55 чистой сывороткой значительно уменьшается, достигая 1,8 — 1,0% при 3 — 5% этанола.

Подобный эффект можно объяснить тем, что при добавлении этанола к сыворотке происходит высаживание белков таким образом, что они становятся неспособными в дальнейшем связывать меченый лиганд, что является, по-видимому, причиной снижения ингибирующего действия сыворотки крови на связывание меченого лиганда. Из табл.4 также видно, что по мере возрастания концентрации этанола процент ингибирования сывороткой, содержащей 100 нг диазепама/мл, увеличивается, что говорит об увеличении чувствительности метода, В табл,5 представлены данные о влиянии метанола на специфическое связывание Н вЂ” Rp 15 — 1788, а также об ингибировании специфического связывания меченого лиганда чистой сывороткой и сывороткой с концентрацией диазепама 100 нг/мл. Из табл.5 видно, что метанол сильно ингибирует связывание Н-Ro 15-1788 — уже при его з концентрации 0,5%-ное ингибирование достигает 68,5%, При концентрации метанола в инкубационной смеси 1,0; 2,0 и 3,0% ингибирование достигает 81,7; 88,5; 93,1% соответственно. И хотя при концентрации 0,5% ингибирование чистой сывороткой специфического связывания Н-Ro 15-1788 нез значительно, рабочий диапазон метода настолько сужен (счет радиоактивности при этом составляет не более 150 cpm), что ошибка определения составляет более 70%.

В силу этих причин проводить предварительную обработку исследуемого образца метанолом не представляется возможным.

В связи с тем, что зависимость величины F (равной SBp/BSi-1) от концентрации диазепама в сыворотке линейна, в диапазоне концентраций от 10 до 1500 нг/мл мы отказались от построения калибровочной кривой для определения уровня диазепама в исследуемых образцах, а для расчета концентраций использовали коэффициент пересчета К = Fy/100, вычисленный для контрольной сыворотки, Концентрация диазепама выбрана как вызывающая 50%-ное ингибирование специфического связывания Н вЂ” Ro 15 — 1788 в данных условиях поз становки эксперимента, Для более надежного определения коэффициента величины SBp, SBp определяются в 4 параллелях излучения. Распределение ошибки определения при расчете концентраций бензодиазепина в исследуемых образцах с помощью коэффициента пересчета от концентрации диазепама в сыворотке показало, что ошибка определения в диапазоне концентраций от 100 дс 1500 нг/мл не пре1737338

5

50

55 вышает 10 /, в области от 20 до 50 н г/мл она равна 20-15, что является верхней границей допустимой ошибки для биологических методов. Учитывая то, что терапевтический диапазон концентрации диазепама в сыворотке крови составляет 50 — 2000 нг/мл (при различных способах введения лекарственного средства), увеличение ошибки определения при малых концентрациях не снижает достоинств предлагаемого способа. Коэффициент корреляции между добавленным в сыворотку известным количеством диазепама и определенным предлагаемым способом составил 0,97 в диапазоне концентраций от 20 до 2000 нгlмл, что говорит о высокой точности способа.

Предлагаемый способ прост в исполнении, поскольку исключает этапы центрифугирования, переноса аликвот и дополнительного разведения образца при проведении предварительной обработки.

Значительно упрощен расчет концентраций бензодиазепина в исследуемых образцах сыворотки, т.е. исключается построение калибровочной кривой, что уменьшает объем работы. Кроме того, чувствительность способа в 3,2 раза выше по сравнению с прототипом и является достаточной для определения диазепама в сыворотке крови больных, находящихся на курсовой терапии бензодиазепинами, Для определения уровня других бензодиазепинов в сыворотке крови (не диазепама) требуется в качестве контрольной сыворотки использовать сыворотку, содержащую интересующий бензодиазепин.

Упрощение способа определения бензодиазепинов и увеличение чувствительности означает, что предлагаемый способ может быть использован для проведения широкого лекарственного мониторинга в клинической практике, Применение предлагаемого тест-набора для осуществления способа значительно упростит работу персонала биохимических лабораторий. Данный способ может быть использован в клиниках для определения целесообразности применения данного препарата у конкретного больного. Проведение клинико-фармакологических исследований с целью оптимизации психофармакотерапии, например для установления взаимосвязи фармакокинетических параметров после введения разовой тест-дозы и последующей эффективности терапии бензодиазепинами, а также предикция равновесного содержания препарата в сыворотке крови при курсовой терапии на основе тест-дозы, установления зависимости развития побочных эффектов от концентрации препарата в сыворотке, может значительно облегчить выбор препарата для лечения больного, установление оптимальных дозировок, режимов и путей введения. Кроме того, предлагаемый способ может быть использован для исследования фармакокинетики вновь синтезируемых лекарственных соединений класса бензодиазепинов, а также для определения уровня других бензодиазепинов в сыворотке крови больных, т.к. способ является универсальным для препаратов этого класса, Формула изобретения

1. Способ определения бензодиазепинов в сыворотке крови путем обработки сыворотки, смешивания ее с рецепторным материалом и радиоактивным лигандом, инкубации полученной смеси с последующим отделением связанного с рецептором лиганда методом фильтрации, подсчета величины радиоактивности и расчета процента ингибирования связывания в сравнении с контролем, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения стадий, а также повышения чувстви-. тельности, сыворотку обрабатывают этиловым спиртом при объемном соотношении 1:2,25, в качестве радиоактивного лиганда используют Н-Ro 15 — 1788, а в среду инкубации дополнительно добавляют у-аминомасляную кислоту в концентрации

500 мкМ, 2, Среда инкубации для определения бензодиазепинов в сыворотке крови, содержащая рецепторный материал, радиоактивный лиганд, трис-буфер, немеченый диазепам, этиловый спирт, соляную кислоту, воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения качества за счет увеличения чувствительности определения, среда дополнительно содержит у- аминомасляную кислоту, а в качестве лиганда Н-Ro з

15-1788 при следующем соотношении компонентов, на 1мл:

Рецепторный материал 0,136 у-Аминомасляная кислота 5,15

Этиловый спирт 3,0

Н-Ro 15 — 1788 5,88 10 -8,82 10

Немеченый диазепам 3,64 10

-4

Трис-буфер 0,605

Соляная кислота 0,04

Вода Остальное

1737338

Пример

16,7

8,5

1,0

9,5

Концентрация метанола в инкубационной среде, k

0,5

1,0

2,0

3,0

Ингибирование специфического связывания Нз

Ro 15-1788 метанолом, б8,5

81,7

88,5

93,1

Ингибирование специфического связывания HRo 15-1788 сы вороткой без диазепама

Таблица1

Таблица2

ТаблицаЗ

Таблица4

Та блица 5

Ингибирование специфического связывания HRo 15-1788 сы вороткой с 100 нг без диазепама/MR,