Способ культивирования гибридных клеток мыши

 

Использование: иммунология, биотехнология . Сущность изобретения: гибридные клетки мыши ИКО-8, ИКО-10 засевают в питательную среду, содержащую сыворотку крови плодов коров. Вносят предварительно суспендированный в той же среде коллагеновый микроноситель в концентрации 2-3 мг/мл. Клетки инкубируют при 37 С. Выход клеток увеличивается в 2-2,5 раза. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 5/00, 5/02

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ CCCP) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4888716/13 (22) 02.11,90 (46) t5.02.93. Бюл. N. 6 (71) Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии и Научно-производственный центр медицинской биотехнологии (72) В.В,Новиков, Л,З,Бирюкова, О.П;Буадзе, В.Ю;.Мостовая и Б.Б.Егоров (56) Егоров Б.Б. и др, Тезисы докл. контр, Махачкала, II ч., с.216, 1988, Барышников А,Ю, Моноклональные антитела и ксеногенные сыворотки в диагностике лейкоза и лимфосаркомы. Москва, 1984, с.47.

Изобретение относится к биотехноло. гии и касается культивирования гибридных клеток мыши (гибридом), необходимых для производства моноклональных антител. . Известен способ культивирования гибридных клеток мыши путем суспендирования клеток в питательной среде ДМЕМ, содержащей 10% сыворотки крови плодов коров, с последующим инкубированием при.

37 С.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода клеток и продуцируемых ими моноклональных антител.

Цель изобретения — увеличение выхода гибридных клеток и продуцируемых ими моноклональных антител.

Поставленная цель достигается тем, что способ выращивания гибридных клеток осуществляют путем суспендирования клеток в питательной среде, содержащей сыворотку крови плодов коров,. с последующим инкубированием при 370С. При этом суспендирование клеток осуществляют в

„„ Щ „„1794950 Al

2 (54) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК МЫШИ (57) Использование: иммунология, биотехнология. Сущность изобретения: гибридные клетки мыши ИКО-8, ИКО-10 засевают в питательную среду, содержащую сыворотку крови плодов коров. Вносят предварительно суспендированный в тай же среде коллагеновый микроноситель в концентрации 2 — 3 мг/мл, Клетки инкубируют при 37 С. Выход клеток увеличивается в 2-2,5 раза, 1 табл. присутствии коллагеновых микроносителей, концентрация которых в питательной среде составляет 2 — 3 мг/мл.

Отличительным признаком описываемого способа является проведение суспендирования клеток в присутствии коллагеновых микроносителей, взятых в концентрации 2-3 мг/мл. О

Коллагеновые микроносители пред- фь. ставляют собой порошкообразную массу с ) частицами размером по длине 180+60 мкм (д диаметром 80.— 100 мкм. С) Пример 1, Во флакон со средой ДМ ЕМ стерильно после добавления сыворотки крови плодов коров из расчета 10% и гентамицина в конечной концентрации 0,8 мгlмл пипеткой вносят в суспендированный в этой же среде коллагеновый микроноситель, доведя его до концентрация 3 мг/мл. Затем во флакон переносят гибридные мышиные клеткилинии ИКО-8 1 так, чтобы их конечная концентрация в суспензии составила 5х10

1794950

35 кл/мл. Флакон помещают в термостат и выдерживают при 37 С.

Через 46 ч концентрация гибридных клеток составляет 5,6х10 кл/мл, а титр моноклональных антител в культуральной жидкости — 1:50, в то время как по протоколу в контроле без добавления микроносителя концентрация гибридных клеток равна

2х10 кл/мл, а титр моноклональных антител в культуральной жидкости 1:10. Титр ан- 10 .тител определяют в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве антигенного материала мононуклеарных клеток периферической крови здоpoBblx лиц, Пример 2. Во флакон со средой ДМЕМ стерильно после добавления сыворотки крови плодов коров из расчета 10 и гентамицина в конечной концентрации 0,8 мг/мл пипеткой вносят суспендированный в этой 20 же среде коллагеновый микроноситель, доведя его концентрацию до 2 мг/мл. Затем флакон засевают гибридными мышиными клетками ИКО-10 2 так, чтобы их конечная

5 25 концентрация в суспензии составила 4х10 кл/мл. Флакон помещают в термастат и выдерживают при 37 С.

Через 48 ч количество гибридных клеток составляет 4,8х10 кл/мл, а титр монокло6 нальных антител в культуральной.жидкости 30

1:50, в то время как в контроле по протоколу беэ добавления микроносителя концентрация гибридных клеток равна 2,3х10 кл/мл, 6

Формула изобретения

Способ культивирования гибридных клеток мыши, включающий посев клеток в питательную среду, содержащую сыворотку крови плодов коров, инкубацию при 37 С, а титр антител равен 1;1, Титр антител определяют в реакции непрямой иммунофлюоресценции с использованием в качестве антиген-положительных клеток фиксированных ацетоном тимоцитов эмбрионов человека.

Обоснование выбора оптимального интервала концентраций коллагенового микроносителя представлено в таблице.

Предлагаемый способ разработан в лаборатории моноклональных антител Горьковского НИ И эпидемиологии и микробиологии Минздрава РСФСР и в лаборатории полимерных носителей Научнопроизводственного Центра медицинской биотехнологии Минздрава СССР и проверен в лаборатории иммунодиагностики и диспансерного наблюдения вирусных гепатитов Горьковского НИИЭМ. Акт проверки прилагается; Планируется использование метода при крупномасштабном производстве диагностических и терапевтических препаратов моноклональных антител с использованием управляемого аппаратного культивирования. Предлагаемый способ позволяет повысить выход гибридных клеток и продукцию ими моноклональных антител но сравнению с известным. Кроме того, способ может быть использован для аппаратного культивирования гибридом с целью наработки массовых количеств диагностических или терапевтических моноклональных антител. отличающийся тем,что,сцелью увеличения выхода гибридных клеток и моноклональных антител, культивирование осуществляют в присутствии коллагенового микроносителя в концентрации 2-3 мг/мл.

1794950

Конечная

Примечание

Титр антител**

Штамм гиб- КонцентраИсходная концентрация клеток, кл/мл концентрация клеток, кл/мл ридных кле- ция микроноток сителя, мгlмл

Низкие титры антител

4,5х10

4,0х10

ИКО-8

Низкие титы антител

Ф!

Низкие титры антител

4,5х10

45х10!

И КО-10

Низкие титры антител

*Концентрацию клеток определяли после разрушения микроносителя раствором трипсина

**Титр антител определяли в реакции непрямой иммунофлуоресценции

Составитель Г, Борискина

Редактор 8, Трубченко Техред М,Моргентал Корректор Т, Палий

Заказ 407 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

0,5

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

0,5

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

2,6х 10

2,4х10

3,1 х 10

40х10

5,6х10

1,0х 10

50х10

2,3х10

2,8 х 106

3,5х10

48 106

4.5 х 106

1,4х10

2,0х 10

1:10

1:1

1:10

1:50

1, 50

1:1

1:10

1:10

1:25

1:50

1;50

1,10.

1:1