Способ определения триазиновых гербицидов
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
Г СУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (OCllATEHT CCCP) НАПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К) ПАТЕНТУ
1 и
R, R
1 (2 ) 4356223/13 (2 ) 18.07.88 (4 ) 30.08,93. Бюл. ¹ 32
{3 ) P 3723726.8 (3 ) 17.07.87 (3 )0Е (1) Др, Пфайффер Биоаналютик КГ (ОЕ) (7 ) Вольфганг Пфайффер, Рудольф Х, Дитте ь и-Вольфганг Мис (DE) (5 )Заявка ЕРА20180305, кл, С 07 D 251/50, 1984. (5 ) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИАЗИНОВ IX,ÃE ÐÁÈ ÖÈÄOÂ (5 ) Использование: определение веществ в ок ужающей среде. Сущность изобретения: дл определения триазиновых гербицидов проводят иммунологическую реакцию, используя антитела, полученные иммуниза! Изобретение относится к иммунологиче кому способу определения веществ в окру, ающей среде, в частности средств для за иты растений в питьевой или грунтовых во ах.
Атразин представляет собой белый порошок без запаха. Химическое название его
2-х ор-4-этиламино-6-изоп ропиламино-1,3,,5- риаэин. В течение вот уже 30 лет он ши око используется в качестве гербицида, Ме аниэм действия его заключается в пода лении фотосинтеза, в результате чего
"сорняки" быстро .засыхают. Атразин испо ьэуется, в частности, для уничтожения со няков на кукурузных полях. Так, в ФРГ
90 всех площадей, занятых под кукурузу, об абатывается атраэином, который. таким об азом, при годовом расходе 1000 т занима т первое место среди других гербици„„>Ц „„l 838787 А3 (н)з G 01 N 33/53, С 07 D 213/00,251/50 цией животных конъюгатами соединений формулы: в которой означают R)-группу HN(CnH2n+1), где и — число от 0 до 8, N(CmH2m+)) где m— число от 1 до 8 галоген или группа ОН, R2— группу НКСяН2т+, где q — число от 0 до 8, и(Сян2В+1)2, где R — число от 1 до 8 или
ГаЛОГЕН, йз — ГаЛОГЕН, SCnH2n+1, Гдв П вЂ” ЧИСЛО от 0 до 8, аминогруппу или HNCmH2mCOOH, где m — число от 1 до 8, причем коньюгирование производят через заместители R>,R2 или Яэ. Иммунологическую реакцию триаэиновых гербицидов осуществляют одновременно или последовательно по меньшей мере с двумя антителами. 2 табл. дов. Наряду с атраэином применяются и другие гербициды, производные триазина, присутствие которых обнаружено в грунтовых и поверхностных водах.
Долгое время считалось, что производные триазина после обработки ими растений постепенно разлагаются и связываются с частицами почвы, и загрязнение ими грунтовых вод, таким образом, исключено. На практике однако оказалось, что эти соединения являются стабильными; время, за которое в почве распадается половина активного вещества, составляет 2-5 месяцев. Из песчаных, а также глинистых и суглинистых почв активное вещество довольно легко вымывается грунтовыми водами. в результате чего остатки триаэина могут обнаруживаться в грунтовых водах и через
1838787 несколько лет. При этом для отдельных веществ верхний предел составляет 0,0001 мг/л (100 нг/л), а суммарное содержание этих веществ не должно превышать 0,0005 мг/л (500 нг/л), Для точного аналитического определения чувствительность анализа должна быть до двух порядков ниже этого значения. Иэзэ большого количества веществ, которые нужно определять, и низких предельных концентраций возникает однако серьезная
10 проблема определения их химическими методами. Физико-химические методы анализа (газовая хроматография,. сочетание газовой громатографии и масс-спектрометрии, высокопроизводительная жидкостная хро." этогрэфия) для идентификации и количественного определения химических веществ требуют трудоемких методов концентрирования. Кроме того, они очень 20 дороги и трудоемки. К тому же эти методы не дают возможности судить о токсичности анализируемых соединений, Современные биохимические методы анализа представляют собой иммунологи- 25 ческие тесты (так называемый "иммуно-анализ"), в которых в качестве испытуемых соединений используются части клеток. Иммунологические методы анализа для анализа вод являются высокочувствительными и наиболее быстрыми и дают возможность быстоо, эффективно и с сравнительно неГольшими за ратами осуществлять мониторинг акружэюгцей среды.
Иммунотесты представляют собой вы- З5 сокочувствительные системы для количестаеннoro определения веществ, основанные нэ реакции антиген-антитело. Для осуществления иммуноанализа вначале индуцируот антитела путем иммунизации 40 лабораторных животных и затем получают их из сыворотки этих животных или продуцирующих их лимфоцитов. Очистку антител осуществляют на колоннах для аффинной хроматографии, содержащих в-качестве ма- 45 териала-наполнителя, например агарозу.
Антитела представляют собой одну из природных защитных систем высших животных организмов. Защитная функция основана нэ том, что при прививке естественной или 50 искусственной инфекции индуцируются специфические антитела. Предпосылкой образования антител является определенная величина молекул. Для индуцирования образования специфических антител по отно- 55 шению к очень. маленьким молекулам, например средствам для защиты растений, их гаптены перед иммунизацией необходимо закрепить на молекуле-носителе с высоклм молекулярным весом, например белке (гемоцианин, альбумин бычьей сыворотки, альбумин яйца, тироглобулин, полилиэин и др.).
Для определения химического вещества используют только такую связь антигенантитело, которая возникает при добавлении к антителу.пробы, содержащей химическое вещество, являющееся антигеном. В классическом иммуноанализе определяемые антигены конкурируют с аналогичными по специфичности антигенами, меченными радиоактивной меткой, за места связи на антителе. В последнее время наряду с радиоиммунным анализом (РИА) большое значение приобрел ферментный иммунный анализ (ФИА), в котором антиген с радиоактивной меткой заменяется коньюгатом фермент-антиген, который затем может конкурировать за свободные места связи на антителе с антигенами пробы, При таком конкурирующем ФИА происходит конкуренция между определенным количеством меченного ферментом антигена.и антигеном пробы за места связи на антителе, которые в свою очередь.за счет адсорбционных или ковалентных сил связаны с поверхностью носителя, например поверхностью полистирола, При небольшой концентрации антигенов в пробе с антителом связывается большое количество ферментной метки (высокая степень расхода субстрата) и, наоборот, при высокой концентрации антигенов в пробе с антителом связывается лишь небольшое количество ферментной метки (низкая степень расхода субстрата). Ингибирование связи ферментной метки является, таким образом, функцией концентрации антигенов в пробе. После отделения несвязанной ферментной метки путем отмывки можно по степени расхода субстрата определить долю связанного меченного ферментом антигенэ и тем самым концентрацию антигена в пробе, Мерой количества связанной ферментной метки является абсорбция прореагировавшего субстрата. С помощью вышеописанной техники индуцируют специфические по отношению к различным пестицидам антитела, а иммуноанализ, являясь быстрым, высокоселективным и тем самым сравнительно недорогим методом анализа, дает решение проблемы определения этих веществ. Нередки однако случаи, когда однозначная идентификация и количественное определение на основе перекрестных реакций с помощью такого иммуноанализа невозможны, Под перекрестной реакцией имеется в виду явление, заключающееся в том, что антитела
"распознают" одинаковые функциональные группы в молекулах различного строения, 1838787
1 руппируя эти различные молекулы по принипу одинакового воздействия, При этом днако нельзя сделать различия между отельными молекулами. Особенно ярко этот ффект проя.вляется в случае небольших мо- 5 екул (антигенов), так как они должны быть вязаны с матрицей (белком), и поэтому познавательным регионом является не вся олекула, а лишь ее отвращенная от матри<,<ь< сторона. В результате молекулы с одина- 1 овой структурой у этой отвращенной тороны часто становятся неразличимыми с омощью иммуноанализа. С другой стороны, во многих случаях перекрестная реакия является как раз желательной, так как с 1 е помощью можно определять не только нтигены, используемые специально для олучения антитела, но и соединения аналогичного химического строения или с такой е биологической активностью, как и ис- 2 ользуемый антиген. Целенаправленно рименяя перекрестные реакции, в ходе одого теста можно определять различные, но тносящиеся по воздействию к одному к ассу вещества. Это особенно ценно при 25 еобходимости оценки токсичности еще незученных соединений. Благодаря этому ажно свести к минимуму опыта на живот <ых и биологические тесты, так с помощью вышеописанного принципа разделения на 30 к ассы по действию становится возможным сделать предварительную оценку экотоксикрлогической опасности еще неисследованных соединений.
Задачей настоящего изобретения явля- 35 естся разработка иммунологического способ а определения, с помо<цыо которого множно было бы определять триазиновые г рбицидь< и соединения с аналогичным хи- мическим строением или одинаковой биоло- 40 г< ческой активностью, относящиеся по д;йствию к одному классу, и который бы в т же время позволял однозначно идентиф цировать отдельные химические соедин ния в сложных смесях, 45
Решением указанной задачи является и имунологический способ определения соединений формулы от 0 до 8, NLC Rz — группу HNCqHzq+p, причем q означает 0 целое число от 0 до 8, N(CrHzr+l)2, причем г означает целое число от 1 до 8, Н<ч-CqН2яY причем Y означает циано-, амина-, азидоили СООН-группу, a q целое число от 1 до 8. N CrH2r+1 2, причем Z означает цианоами5 но-, азидо- или С00Н-группу или группу CqHzq. a r u q целое число от 1 до 8, азид, атом галогена, SH-группу или ОН-группу; Вз — атом галогена. SCnH2n+li причем и означает целое число QT 0 до 8, OCnHzn+1, при0 чем п означает целое число от 0 до 8, циано- сарбоксильную, амино- или СНОгруппу, причем заместитель Кз может находиться в мета-положении относительно Ri u Rz или s орто- или пара-положении относительно В< ий2, отличающийся тем, что закреплением указанного соединения (I) (антигена) на матрице через заместители R<, R2 или <<з экспонируется только часть его молекулы: иммунизацией подопытных животных получают антитела А, В, или С, предпочтительно реагирующие на эту экспонированну<о часть молекулы соединения (I), и для иммунологического определения соединения (i) предположительно содержащую его пробу в сериях опытов одновременно или в различной последовательности подвергают взаимодействию с по меньшей мере двумя из вышеуказанных антител А, В, или С и на основании образования в сериях опытов связи антиген-антитело проводят количественное и качественное определение соединения (I). По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения соединение формулы (I) представляет мета-замещенное шестизвенное ароматическое кольцо, содержащее до трех атомов азота. Наиболее предпочтительными при этом являются про.<вводные пиридина, пиримидина или триазина. По предпочтительному варианту осуществлеMèÿ предлагаемого способа для иммунологического определения три антитела А, В и С используются в сериях опытов в следующей последовательности: первая серия: АВС; вторая последовательность: ВСА; третья последовательность: САВ; При этом пробу с определяемым веществом по отдельности подвергают взаимодействию с каждым из указанных антител, Для этой цели исследуемые растворы мож50 55 в которой Х, Х, X означают атом углерода или амлота. 4 6 Х, Х, Х -- атом углерода; R < — группу Н (С,Н2,+<), причем и означает целое <исло 1838787 35 k0 вводить с помощью пипетки в реакционные сосуды или полости пластин для микротитровани я с находящимися в них соответствующими антителами, По другому предпочтительному варианту осуществления способа исследуемую пробу вначале подвергают взаимодействию с первым антителом из каждой серии, затем отделяют непрореагировавшую надосадочную жидкость и подвергают ее взаимодействию со следующим антителом серии. В отдельных случаях при проведении предлагаемого способа может оказаться целесообразным с помощью гибридной техники, путем переработки полученных из подопытных животных сывороток или продуцирующих антитела лимфоцитов получать моноклональные антитела и уже их использовать для анализа. Иммунологический способ в соответствии с настоящим изобретением, при использовании реакционной способности к перекрестным реакциям, наряду с соединениями (1) позволяет проводить анализ и других соединений аналогичного строения, 5 25 относящихся к тому же классу соединений, а также соединений отличного строения, которые однако обладают такой же биологической активностью и аналогичным поведением в отношении образования свяэей. Иммунологическое определение с использованием реакции антиген-антитело по. способу в соответствии с настоящим изобретением предпочтительно проводят с помощью антигена с радиоактивной меткой или антигена, связанного с ферментом, флуоресцирующим соединением или веществом, генерирующим электрические сигналы (биосенсором), В ходе анализа происходит конкуренция антигена пробы и меченного или связанного антигена (реактива) за места связи с антителом. После этого несвязанный с антителом свободный реактив отмывают и, измеряя интенсивность радиоактивного излучения, величину, абсорбции, флуоресцентное излучение или электрический сигнал, определяют тем самым количество связанного реактива и, следовательно, концентрацию антигена в растворе. Иммунологический способ определения в соответствии с настоящим изобретением позволяет проводить анализ соединений определенного класса активности и в то же время идентифицировать отдельные вещества этого класса. Он представляет собой быстрый, высокоселективный и недорогой способ, с помощью когорого можно проводить анализ большого 55 количества веществ, находящихся в окружающей среде, чего невозможно, несмотря на автоматизацию, сделать с помощью обычных аналитических методов, Положенные в основу способа принципы позволяют проводить оценку экологической токсичности еще неисследованных соединений, классифицируя их по активности, Более подробно изобретение поясняется на следующих примерах. Пример 1. Описаны получение трех различных антител А, В и С, каждое иэ которых предпочтительно воздействует на одну из частей молекулы гербицида атразина, наиболее характерного представителя соединений формулы (I). а также вариант осуществления предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением иммунологическог0 способа определения. Для получения антитела А, предпочтительно воздействующего на часть молекулы атразина вначале проводят реакцию сульфоксидирования метилтиоэфирной группы триазина аметрина надкислотой и затем непосредственно закрепляют модифицированный таким образом аметрин на альбумине бычьей сыворотки, Аналогичным образом для получения антитела В, предпочтительно реагирующего на часть молекулы атразина одну из этиламино-групп триазина симазина с помощью карбодиимидного способа связывают с белком. И, наконец, антитело С. предпочтительно реагирующее на часть молекулы атразина может быть получено путем связывания гербицида пропазина с матрицей через изопропиламиновые группы. H 3 М cl (н ) (сБз) Н< Полученные вышеописанным образом коньюгаты вводятся для индуцирования антител А, В и С подопытным животным (кроликам), которые затем получаются из сыворотки иммунизированных животных 1838787 55 звестными способами, в частности с поощью аффинной хроматографии, с испольованием заместителей в соответствии с ормулой (1). Полученные антитела абсорбируют на оверхности полистирола полостей пластин ля микротитрования. Для этого растворят антитела в карбонатном буфере (а2СОз/йаНСОз 50 ммоль/л; рН 9,6), доавляют в полости пластины для микротитования пипеткой по 0,25 мл полученного аствора, оставляют пластины на ночь при омнатной температуре и на следующий ень промывают их TBS-буфером. Хорошо одгатовленные пластины хранят сухими ри -20 С. Для анализа в полости вносят 80чл пробы исследуемого водного раствоа (концентрация определяемого вещества т 1 мкг/л до 200 мг/л) и добавляют по 50 кл ферментнай метки, представляющей абай конъюгат щелочной фосфатазы и тризина, природа которого определяется в заисимости от выбранного антитела. Если нализ проводят с антителом А, то с ферентом связывают аметрин. При работе же антителом В или С применяют соответстенно симазин или пропазин. Резким встряхиванием микротитроальной пластины в горизонтальной плоскоти смешивают растворы. После инкубации течение еще часа при 20ОС удаляют путем отмывки TBS-буферрм (50 ммол/л трио/окиметил/-аминометана, 1 ммол!л Mg Clz, 50 мол/л йаCI, рН 7,8 за счет НCI, 0,05 / олиоксиэтиленсорбитанмоноолеат) все не связанные с антителам молекулы. Для колиественного определения связанного мееннога фермента в полости добавляют по 125 мкл раствора субстрата фосфатазы (1 мг и-нитрофенилфосфата на мл крабонатного буфера). Ферментная реакция протекает при 20 С. Ее однако можно ускорить инкубацией при повышенной температуре. Поглощение раствора в полостях определяют ,с помощью фотометра с вертикальным пучком света, при длине волны 405 км. Для того, чтобы повысить чувствительность, рекомендуется оставлять пластины на ночь при 4 С. При этом однако следует считаться с тем, что если не предъявлять специальных требований к чистоте реактивов, приборов и помещения, то невозможно добиться воспроизводимых результатов при концентрациях порядка м,т, Расчет концентрации антигена в пробе, производят исходя из следующих сообра-! жений. Меченный ферментом антиген свя1, зывается прежде всего с теми местами антитела, которые остаются свободными ., после инкубации его с антигеном пробы. Так, при высокой концентрации ан игенов пробы связывается лишь небольшое количество ферментной метки. Г!ри низкой же концентрации антигенав пробы, наоборот, связывается большое количество ферментной метки. Количество связанной ферментной метки является, таким образом, функцией концентрации антигена в пробе. Мерой количества связанной ферментной метки служит величина абсорбции прореагировавшего субстрата (цветная реакция с переходом от бесцветного к желтому цвету). Расчет. Отношение абсорбции определяемой (А=Ав-Avв) и нулевой проб (ВО=Аво — Ачв) В/ВО=-(Ав— - Aчв):(Аво — Ачв). где В/ВΠ— отношение количества связанной ферментной метки в присутствии антигена (В) к количеству связанной ферментной метки в отсутствии антигена (ВО); Аво — абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в отсутствии антигена (ВО): Ав — абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в присутствии неизвестной концентрации антигена (гербицида) в пробе; Аов — абсорбция (при 405 нм) в качестве меры количества связанной ферментной метки в отсутствии париетальных антител. Если нанести значения В/ВО по оси иуи относительно логарифма концентрации гербицида, то получается сигмоидная кривая. Для спрямления кривой для большего удобства работы предложено по оси иум также откладывать логарифмические значения (логарифмические координаты). Для оценки однако оказалось целесообразнее выражать степень торможения (1 — B/ВО) через интеграл нормального распределения. На практике для этой цели вместо частоты на вероятностную бумагу наносят процентное торможение (100*/1 — B/BO). В результате происходит спрямление сигмоидной кривой. Для определения антигена в пробе в отдельных опытах исследуемую пробу обрабатывают по отдельности или в определенной последовательности каждым из используемых антигенов. В случае последнега способа оказалось, что в каждг,й серии опытов одна и та же степень ингибирования наблюдается, когда экспонированные части молекул, по отношению к которым являются активными различные антитела, находятся в различных молекулах. Если же по меньшей мередве экспанированные части находятся в одной молекуле, то наблюдается разброс. Это объясняется тем, что молекула, содержащая две такие зкспонированные части, 1838787 вследствие связывания с антителом KBK за счет одной, так и за счет другой части, удаляется из раствора и поэтому после переноса раствора в следующую полость она уже не может принять участия в связывании. Если рассмотреть все другие возможности связывания, то можно получить следующую матрицу ингибирования (табл. 1), из которой вытекают основные структуры. Приведенную матрицу ингибирования можно легко расширить за счет применения других антител, что даст возможность анализировать и более сложные молекулы или смеси молекул. Пример 2. Для того чтобы иметь гозможность классифицировать триазины по их актив ости, определяли их реакционную coocobllc.сть к перекрестной реакции «О OTНOШЕНИЮ К СОЕДИНЕНИЯМ, ПЕРЕЧИСЛЕНным в табл. 2. Для обеспечения BLIcoKQA специфичности к атразину иммунизацию роводили таким образом, чтобы происхо;",и;fo спсцифическое экспонирование ал,.ильно о, изопропилового и этилового ос r P TKoa, В нижеследующей таблице приведены значения степени ингибирования (%) ocLloâHLlõ представителей отдельных классов вегцеств. Прочная связь антигена с ангит..лом обусловливает и сильное ингибирование ферментной системы. Из вели ilnHbl торможения можно определить степень взаимодействия антитела с антигеном. Привсденные в табл, 2 значения ингибирования свидетельствуют о TQM. что при, казанной концентрации (2 части на млрд) селект ивность антител не очень высока, однако перечисленные соединения, которые воздействуют и на фотосистему l l, могут быть определены и иммунологическим ме5 тодом, С помощью иммуноанализа в сооТветствии с настоящим изобретением, целенаправленно используя реакционную способность к перекрестной реакции, можно делать выводы о структуре присутствую10 щих в смеси соединений (сравни пример 1). Формула изобретения Способ определения триазиновых гербицидов, включающий постановку иммунологической реакции испытуемой пробы с 15 антителами, отличающийся тем, что, с целью повышения селективности и чувствительности способа, используют антитег,. полученные иммунизацией животных соединениями формулы К 25 где R> - группа НМ(СлН2л+ ), где и — 0 8; М(Сп lcm )p, где m — 1-8, галоген или группа ОН, Rz — группа НЙСчНгя+1, где q — 0-8, М(СвН2я+ )2, где R — 1 — 8, или галоген; Вз— 30 галоген, SCnk2n>1, где Ti — 0-8, аминогруппа или HNСЛ Н2 лСООН, где m — 1-8, причем коньюгирование производят через заместители Rn, Кр или R3, а иммунологическую реакцию осуществляют одновременно или 35 последовательно по меньшей мере с двумя антителами. 183878/ 13 Таблица 1 Матрица ингибирования Первая серия опытов Вторая серия опытов Третья серия опытов САВ + + + А В С ВСА + + + Независимо друг от друга имеются все части II, П1, К Все части Н, Ш, IV содержатся в одной молекуле (I компонент) Части II и 111 находятся в одной молекуле (2 компонента ) + + + + Части )! и IV находятся в одной молекуле (2 компонента ) Части III u IV находятся в одной молекуле (2 компонента) + = торможение связывания ферментной метки — = отсутствие торможения связывания ферментной метки. Таблица 2 Реакционная способность к перекрестной реакции различных гербицидов при концентрации 2 части на млрд Ингибирование Класс соединений Соединение Триазины 8,3 Метабензтиазурон 4,4 6,7 11,1 Феназафлор Метрибузин Бромазил Анилиды Производные мочевины Производные трифторобензимидазола Аминотриазины Урацилы Атразин Окси-3-изопропил-атил-триазин Аметрин Дезэтиламетрин Дезизопропиламетрин Метазахлор 6,0 5.3 21,4 16.8 16,5 15,2
