Способ получения хромогенного субстрата для определения хитиназной активности
Использование: энзимология, микробиологическая промышленность в качестве субстрата для определения хитиназной активности в ферментных препаратах и биологических средах. Сущность изобретения: осуществляют окрашивание коллоидного хитина тиазиновым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М, путем инкубирования реакционной смеси при 100°С в течение 10-30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10-15 мас.%. 1 з.п.ф-лы, 4 ил.
СОГОЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
PЕСПУВЛИК!
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГДСПАТЕНТ СССР) ПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПАТЕНТУ а р
В
Изобретение относлтся к способам полу ения окрашенных соединений и может бь ть использовано в энзимологии, микробиологической промышленности в качестве субстрата для определения хитиназной ак. тивности в ферментных препаратах и биологических средах.
Хитинолитические ферменты являются о ьектом углубленных исследований, пос ольку во многом определяют пути превраений и утилизации хитина в природе. Не м нее важным является значение хитиназ, к к ферментов, способных расщеплять хитин в составе патогенных грибов и насекомых. Тем самым, хитиназы (или композиции ! н их основе) являются готенциальными энт мопатогенными и противомикозными и паратами, В связи с лзложенным, разра(2 (2 (4 (7 н (7 (7 (5
Н б
) 4927732/13
) 15,04.91
) 30.01.93, Бюл. N. 4
) Межотраслевое научно-производствене объединение "Биостарт"
) А.Б,Дужак
) А.Б.Дужак
) Riden Н., Rlnderknecht H., Wilding P., verback В.l, А new method for the
termination of а-amila e. — Experientia, 1967, 3, N. 10, р.805, Serre L., Lauriere С„Specific assay of
dextrin 6-glucanohydro.ase using labeled
llulan, — Anal, Biochem. 1990, v.186, ¹ 2, 12 — 315.
Hakman R.h/l., Goldberg М. New
bstrates for use with Chitinases. — Anal.
oche«. 1964, v.8, ¹ 3, р,397-401, ЫХ„„1792428 АЗ
<я>s С 12 Q 1/34, С 12 N 9/42 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХРОМОГЕННОГО СУБСТРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХИТИНАЗНОЙ АКТИВНОСТИ (57) Использование: энзимология, микробиологическая промышленность в качестве субстрата для определения хитиназной активности в ферментных препаратах и биологических средах, Сущность изобретения: осуществляют окрашивание коллоидного хитина тиазиновым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы в концентрации 0,1 — 0,25 М, путем инкубирования реакционной смеси при
100 С в течение 10-30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10 — 15 мас,%. 1 з,п,ф-лы, 4 ил, 1 а 3 ботка аналитических способов для идентификации и тестирования хитиназ является актуальной.
Известен ряд способов анализа хити- 3 наэной активности. Все они основаны на фь, определении растворимых продуктов расщепления хитина хитиназами, Однако боль- (р шинство из эти» способов обладает существенными недостатками: низкой чувствительностью, недостаточной специфичностью, а также использованием при подготовке и проведении анализа высокотоксичных или радиоактивных соединений.
Наиболее простыми и специфичными являются способы тестирования активности хитиназ с использованием хромогенных субстратов, в которых исходные полимеры хитина модифицируют (окрашивают) хромо1792428
55 генными группировками. Результаты анализа хитиназной активности определяют после окончания хитиназной реакции по оптической плотности фильтратов реакционных смесей.
Известен, например, способ получения хромогенного субстрата путем модификации полиглюканов (пуллулана, крахмала) триазиновыми или винилсульфоновыми красителями в присутствии сульфата натрия и ортофосфата натрия в течение 2 часов при температуре 50 С.
Однако такой субстрат для определения хитиназйой активности непригоден, поскольку не расщепляется хитинолитическими ферментами, Наиболее близким к заявляемому способу — прототипом, является способ получения хромогенного субстрата для анализа хитиназной активности, заключающийся в следующем, Взвешивают 1 г порошка нативного хитина, просеянного через сито 200 меш; к навеске хитина добавляют 50 мл 1;4-ного раствора триазинового ("Процион красный
Ж") или винилсульфонового("Ремазол яркоголубой P или "Ремазол ярко-фиолетовый
5Р") красителя в 1М Na0H; полученную суспензию инкубируют 5 мин при температуре
100 С (на кипящей водяной бане); после этого суспензию инкубируют ночь при комнатной температуре; после этого окрашенный хитин промывают дистиллированной водой для удаления несвязанного красителя; после этого окрашенный хитин промывают дополнительно этанолом и диэтиловым эфиром; после этого окрашенный хитин высушивают и используют как хромогенный субстрат для анализа хитиназ.
Хромогенные субстраты для анализа хитиназ производятся по способу-прототипу фирмами США "Сигма" и "Калбиохем", Данный хромогенный субстрат характеризуется эффективностью 0,036. Длительность процедуры синтеза — 10-12 часов.
Эффективность хромогенного субстрата определяют следующим образом, Реакционную смесь, содержащую хромогенный субстрат (3 мг!мл) и хитиназу из
Streptomyces griseus (0,2 мгlмл) в 0,05М ацетатном буферном растворе (рН 5,5) инкубируют при температуре 25 С в течение 18 часов. После этого реакционную смесь центрифугируют (3000 об/мин, 10 мин), надосадочную жидкость собирают. Оптическая плотность надосадочной жидкости при длине волны, характерной для используемого красителя, является эффективностью хромогенного субстрата.
Основным недостатком прототипа является низкая эффективность хромогенного субстрата. Для увеличения эффективности субстрата в прототипе предлагается использовать в качестве исходного полимера вместо альфа-формы хитина его гамма-форму, которая быстрее расщепляется хитиназами.
Такое решение нельзя признать удовлетворительным, поскольку в природе встречается в основном альфа-форма хитина, а гамма-хитин обнаружен только в коконах некоторых жуков и в панцырях отдельных видов моллюсков. В связи с этим, гамма-хитин труднодоступен и не может найти повсеместное применение.
Дополнительным недостатком прототипа является многостадийность и длительность способа синтеза хромогенного субстрата, Целью изобретения является увеличение эффективности хромоген ного субстрата и упрощение способа его синтеза.
Это достигается тем, что в качестве исходного полимера используют коллоидный хитин, который модифицируют триазиновым или винилсульфоновым красителем в растворе, содержащем гидроксид-ионы в концентрации 0,1 — д,25М, путем инкубирования реакционной смеси при температуре
100 С в течение 10 — 30 мин. При этом краситель преимущественно берут в концентрации 10-15%.
Сущность предлагаемого способа заключается в следующем: к коллоидному хитину добавляют раствор, содержащий гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25М и триазиновый или винилсульфоновый краситель в концентрации 10-15 ; полученную суспензию инкубируют на кипящей водяной бане при температуре
100 С в течение 10 — 30 мин; окрашенный хитин отмывают дистиллированной водой от несвязавшегося красителя и используют в качестве хромогенного субстрата для анализа хитиназной активности, Получаемый хромогенный субстрат в зависимсти от вида используемого красителя характеризуется эффективностью 0,55 — 1,2, Длительность процедуры синтеза составляет 30 — 40 мин, Существенными отличительными признаками заявляемого способа по сравнению с прототипом являются следующие.
В качеСтве исходного полимера используют не нативный, а более гидрофильный коллоидный хитин, что позволяет увеличить эффективность хромогенного субстрата в
10-13 раз. Коллоидный хитин значительно
1792428
10
20
25 более чувствителен к действию хитиназ, чем нативный хитин. При этом, повышенная гидрофильность позволяет более эффективно модифицировать коллоидный хитин молекулами красителя. Хромогенный субстрат, порученный из коллоидного хитина в условиях прЬтотипа, обладает эффективностью 0,3-0,4.
В звестных научно-технических источниках ис ол ьзова н ие колл оидно го хитина в качестве ис одного полимера для модификации триазино ыми или винилсульфоновыми красителями с елью получения хромогенного субстрата
" дл тестирования хитиназной активности не об аружено.
Модификацию хитина проводят в раств ре, содержащем гидроксил-ионы с конц нтрацией 0,1 — 0,25М, что позволяет по ысить эффективность хромогенного субст ата, по сравнению с прототипом, в 1,5 ра а, На фиг.1 представлена зависимость от осительной эффективности хромогенного субстрата от параметра рХ, где рХ опреде яется из концентрации гидроксил-ионов (С н-) поформуле: рХ =-14+ Iq Сон-. Изфиг.1 ви но, что при значениях рХ меньше 13 (С н- = 0,1М) и больше 13,4 (Сон- = =0,25М) э фективность хромогенного субстрата сн жается более, чем на 10% от максимально (Сон-=.0,15М). Представленная на фиг,1 за исимость воспроизводится при использо ании в качестве источника гидроксили нов различных гидроокисей (калия, на рия, лития). В известных научно-т хническ х источниках использование заявляемого ди пазона концентраций гидроксил-ионов дл модификации молекул хитина триазиновыми или винилсульфоновыми красителями не обнаружено.
Длительность инкубирования реакцион ой смеси при температуре 100 С (на кипя ей водяной бане) составляет 10 — 30 мин, чт позволяет увеличить эффективность хр могенного субстрата. по сравнению с пр тотипом, еще в 1,25 раза и упростить сп соб получения хромогеннного субстрата дл тестирования хитиназ за счет сокращени количества стадий (на 4 стадии), сокращ ния длительности синтеза хромогенного су страта с 10 — 12 часов до 30 — 40 мин, а та же исключения из способа пожароопасньx реагентов (этанола, диэтилового эфира, На фиг.2 представлена зависимость отно ительной эффективности хромогенного су страта от продолжительности инкубирова ия реакционной смеси при температуре
10 С. На фиг.2 видно, что сокращение прадо жительности инкубирования менее 10 м н приводит к уменьшению эффективност хромогенного субстрата более, чем на !
10% от максимального значения (при длительности инкубирования 25-30 мин). Увеличение продолжительности инкубирования более 30 мин нецелесообразно, поскольку не приводит к дальнейшему повышению эффективности хромогенного субстрата.
Посла проведения синтеза хромогенного субстрата в заявляемых условиях, дополнительного инкубирования реакционной смеси при комнатной температуре в течение ночи, как предлагается в прототипе, не требуется. Дополнительное инкубирование реакционной смеси при комнатной температуре. в течение 0-18 часов не изменяет эффективности заявляемого хромоген ного субстрата.
В известных научно-технических источниках использование заявляемой продолжительности инкубирования реакционной смеси при температуре 100 С для модификации хитина триэзиновыми или винилсульфоновыми красителями не обнаружено, Триазиндвый или винилсульфоновый краситель преимущественно используют в концентрации 10-15%, что позволяет получить дополнительный положительный эффект, заключающийся в увеличении эффективности хромогенного субстрата в
1,5 — 2,5 раза. Уменьшение концентрации красителя ниже 10-15% приводит к снижению эффективности хромогенного субстрата. Увеличение концентрации красителя выше 10-15% нецелесообразно, поскольку указанная концентрация близка к насыщающей для данных красителей и ее дальнейшее повышение затрудняет отмывку хромогенного субстрата от несвязавшегося красителя и, тем самым, усложняет способ получения.хромогенного субстрата для тестирования хитиназ, На фиг,3 представлены сравнительные данные по эффективности заявляемых хромогенных субстратов (1 — 4) и эффективности прототипа (5), где для синтеза хромогенных субстратов использовали: 1 — триазиновый краситель "Реактив красный 4" (фирмы
"Сигма" ); " — триазиновый краситель "Процион ярко-голубой М-Р" (фирмы "Серва" ); 3 винилсульфоновый краситель "Ремазол ярко-фиолетовый 5Р" (фирмы "Сигма" ); 4 и 5 — триазиновый краситель "Реактив красный
120" (фирмы "Сигма" ). Из фиг.3 видно, что заявляемые хромогенные субстраты, получаемые с разными красителями, отличаются между собой по эффективности не более, чем в 2 раза, Такой разброс эффективностей, по-видимому, отражает различия красителей в спектральных свойствах и реакционных способностях. Тем не менее, все заявляемые хромогенные субстраты в
1792428
15 — 30 раз превышают по эффективности субстрат, полученный в условиях прототипа.
На фиг.4 представлен линейный участок зависимости скорости гидролиза заявляемого хромогенного субстрата, модифицированного "Реактивом красным 120", от концентрации препарата хитиназы из
Streptomyces griseus. Условия гидролиза: концентрация хромогенного субстрата 3 мг/мл в 0,05М ацетатном буферном растворе рН 5,5, температура 50 С, продолжительность реакции 30 мин, Из фиг.4 видно, что заявляемый хромогенный субстрат позволяет определять хитиназную активность в широком диапазоне концентраций фермента, Пример 1, К пасте коллоидного хитина, содержащей 1 г основного вещества (в пересчете на сухой вес), добавляют 100 мл
10 -ного триазинового красителя "Реактив красный 120" в 0,15М КОН и инкубируют в течение 30 мин при температуре 100 С (на кипящей водяной бане), После окончания инкубировэния осадок окрашенного хитина собирают центрифугированием (3000 об/мин. 10 мин) и промывают дистиллированной водой для удаления несвязавшегося красителя. К отмытому хромогенному субстрату добавляют дистиллированную воду, доводя общий объем суспензии до 100 мл (концентрация хромогенного субстрата око., ло 10 мг/мл), Эффективность хромогенного субстрата — 1,2, Суспензию хромогенного субстрата хранят в темноте при температуре 4-8 С в течение нескольких месяцев, Пример 2. Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1, но окрашивание производят винилсульфоновым красителем "Ремазолом ярко-фиолетовым 5Р" с концентрацией 15 в 0;15M NaOH. Эффективность хромогенного субстрата — 1,05.
Пример 3. Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1,.но модификацию коллоидного хитина производят в 0,25M NaOH; Эффективность хромогенного субстрата — 1,08.
Пример 4, Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1, но модификацию коллоидного хитина производят в 0,1М КОН. Эффективность хромоген ного субстрата — 1,08.
Пример 5. Получение хромогенного субстрата осуществляют аналогично примеру 1, но реакционную смесь инкубируют в течение 10 мин. Эффективность хромогенного субстрата — 1,05.
Пример 6. Определение хитиназной активности (ХА) с помощью заявляемого хромогенного субстрата.
AV
XA=
25
40 вляют аналогично примеру 6, но используют хромогенный субстрат, полученный по примеру 2, оптическую плотность измеряют при длине волны 560 нм (й = 0,36), а козффици45 ент К принимают равным 1,4 мкмоль, XA составляет 0,34 ед.акт,/мг.
Пример 8. Определение XA осуществляют аналогично примеру 6, но в качестве тестируемого и ре па ратв испол ьзуют хити50 назу из Serratia marcescens, А = 0,26. XA ферментного препарата хитиназы из Serratia
marcescens составлязт 0,22 ед,акт./мг.
Пример 9. Определение XA осуществляют аналогично примеру 7, но в качестве
55 тестируемого препарата используют хитиназу из Serratia marcescens. А = 0,23. XA составляет 0,22 ед.акт./мг, Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом
В две пробирки приливают по 1 мл 1 ной суспензии хромогенного субстрата, полученного по примеру 1, по 0,6 мл 0,25М ацетатного буферного раствора (рН 5,5) и
1,25 мл дистиллированной воды. В одну пробирку (тест-проба) приливают 0,15 мл раствора ферментного препарата хитиназы из
Streptomyces griseus с концентрацией 0,5 мгlмл. В другую пробирку (контрольная проба) приливают 0,15 мл дистиллированной воды. Обе пробирки инкубируютс периодическим перемешиванием в течение 30 мин при температуре 50 С, После этого обе пробы центрифуги руют (3000 об/мин, 10 мин). Надосадочные жидкости собирают и измеряют в тест-пробе против контрольной пробы оптическую плотность при длине волны 512 нм. XA определяют по формуле где А — оптическая плотность в тест-пробе при длине волны 512 нм (А = 0,4);
V — обьем реакционной смеси, мл (V = 3мл);
Р— количество ферментного препарата, мг (Р = 0,075 мг);
Т вЂ” п родолжител ь ность реакции, мин (T
= 30 мин);
К вЂ” коэффициент пересчета оптической плотности в концентрацию N-ацетилглюкозамина, мкмоль (К = 1,6 мкмоль ).
Зэ единицу XA принимают такое количество фермента, которое в приведенных условиях реакции образует 1 мкмоль N-ацетилглюкозамина в минуту. ХА ферментного препарата хитиназы из Streptomyces
griseus составляет 0,33 ед.акт./мг, Пример 7, Определение XA осущест!
9 1792428 10 увеличить эффективность хромогенного субстрата в 15-30 раз; упростить способ получения хромогенного субстрата за счет: а) сокращения количества стадий (на 4 5 стадии); б) сокращения длительности синтеза хр могенного субстрата с 10-12 часов до
3 — 40 мин; в) исключения из способа пожароопас- 10 нь х реагентов (спирт, эфир).
Формула изобретения
1. Способ получения хромогенного субст ата для определения хитиназной активност, включающий модификацию исходного 15 и имера триазиновым или винильсуфоноЩ
is ор ч рХ
12, Фиг.I
Я Враи . чу
20 9 с! %0 40!
I . 8
20 s бО
Ъ g И
8. И вым красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы, инкубирование реакционной смеси при 100 С и отделение несвязавшегося красителя промыванием, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения эффективности целевого продукта и упрощения способа его получения, в качестве исходного полимера используют коллоидный хитин, модифицированный красителем в растворе, содержащем гидроксил-ионы в концентрации 0,1-0,25 М, а инкубирование реакционной смеси осуществляют в течение
10 — 30 мин, 2. Способ пои.1, отлича ющийся тем, что краситель берут в концентрации
10 — 15 мас. О .
1792428
100
1 2 3 Ч 5
Фиг.3
4 sr
80 ® к)нццыр ра сия хип ин 3 . sr/
Фог.4
Редактор
Составитель А, Дужак
Техред М.Моргентал Корректор О, Кравцова
Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина. 101
Заказ 169 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР.
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
