Способ получения коллагеназы

 

Использование: биотехнология на рыбообрабатывающих предприятиятих при утилизации отходов производства. Сущность изобретения: способ предусматривает обработку панкреатосодержащего сырья гидробионтов водным раствором детергента с концентрацией 0,5 - 1,5 об. % при соотношении к сырью 0,8 : 1 - 1 : 1 для фракционирования, отделение твердой части, обработку последней буферным раствором, центрифугирование, концентрирование, очистку и сушку.

Изобретение относится к рыбной промышленности и может быть использовано на рыбоперерабатывающих предприятиях при утилизации отходов производства.

Известен способ выделения коллагеназы из тканей животных [1] , предусматривающий обработку сырья различными буферными растворами. Этот способ длителен во времени и требует дорогостоящего оборудования.

Известен также способ выделения коллагеназы из микроорганизмов [2] . Данный способ также предусматривает обработку сырья различными буферными растворами. Недостатки этого способа те же, что и вышеупомянутом способе.

Наиболее близким техническим решением к заявленному способу является способ получения коллагеназы из гепатопанкреаса краба, согласно которому гепатопанкреас краба гомогенизируют в растворе сульфата аммония, доводя насыщение до 1,02, отделяют осадок, растворяют его в дистиллированной воде, раствор диализируют, сушат продукт лиофилизацией [3] .

Однако данный способ отличает длительность во времени и отсутствие стадии удаления из сырья липидных фракций, которые впоследствии мешают на стадиях очистки препарата.

Целью изобретения является увеличение выхода препарата посредством снижения доли липидов в сырье и снижение себестоимости продукта.

Цель обеспечивается тем, что сырье на первой стадии обрабатывается раствором детергента (ПАВ) при концентрации 0,5-1,5% в соотношении к сырью 0,8: 1 - 1: 1.

Способ осуществляется следующим образом. Отходы рыбоперерабатывающих предприятий, например печень краба, фракционируют. Для этого сырье обрабатывают холодным водным раствором детергента в количестве 0,5-1,5% и соотношении к сырью 0,8: 1 - 1: 1. В качестве детергента можно использовать додецилсульфат натрия, сульфирол-8 (натрий 2-этилгексилсульфат), пенообразователь N 2 (смесь натрийалкилсульфатов с числом С-атомов 10-13) алкилсульфат пасту (натрий алкилсульфаты на основе первичных спиртов с числом С 10-18). В предложенном способе при заявленных режимах фракционирование осуществляется в пределах получаса. Проведение фракционирования при значениях ниже границы заявленных диапазонов концентрации и соотношения детергента не обеспечивает в достаточной мере протекание процесса. Проведение же фракционирования за верхними пределами заявленных режимов приведет к увеличению расхода химических агентов.

В предложенном способе фракционирование осуществляется для удаления липидной фракции, мешающей последующему ведению процесса. Причем фракционирование проводят при щадящих режимах: низкой температуре, слабой концентрации и малом времени, при этом сам продукт остается без загрязнения.

После фракционирования отделяют твердую часть, например, фильтрованием. Отделенную твердую часть обрабатывают охлажденным буферным раствором, в качестве которого можно использовать 0,05М трис HCl, содержащего 0,005 М СаCl₂.

Обработку буферным раствором проводят для выделения комплексов водорастворимых белков и ферментов. Время обработки буферным раствором соизмеримо с временем фракционирования. Обработанную смесь центрифугируют для отделения раствора фермента.

Отделенный раствор ферментов концентрируют с помощью диализа. Получают концентрированный раствор протеолитических ферментов с выраженной коллагенолитической активностью. Для повышения активности препарата его очищают от примесей других ферментов и сушат.

П р и м е р 1. 50 г печени краба обрабатывают раствором детергента (додецилсульфат натрия). Количество детергента 0,75 г (1,50), воды 49,25 г. Соотношение детергент-сырье 1: 1. Время обработки 30 мин. Раствор отделяют фильтрованием. Количество твердой части (осадка) 40 г. Осадок обрабатывают 0,05 М трис HCl буферным раствором с 0,005 М CaCl₂ в количестве 240 г в соотношении 1: 6 в течение 30 мин. Супернатант отделяют центрифугированием, подвергают диализу и сушат. Получают ферментный препарат в количестве 111 мг при коллагенолитической активности 200 ед/г.

П р и м е р 2. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что количество детергента 0,25 г (0,5% ), количество воды 49,75 г, количество твердой части 43 г, соотношение детергент: сырье 0,8: 1, количество буферного раствора 258 г. Выход препарата составляет 104 мг при той же активности.

П р и м е р 3. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что количество детергента 0,2 г (0,4% ), количество воды 49,8 г, количество твердой части 47 г, а количество буферного раствора 282 г. Выход препарата составляет 45 мг. Способ по данным режимам не рекомендуется из-за низкого выхода готового продукта.

П р и м е р 4. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что количество детергента 1 г (2% ), количество воды 49 г, количество твердой части 41 г, а количество буферного раствора 246 г. Выход препарата составляет 109 мг. Способ по данным режимам не рекомендуется, поскольку выход готового продукта не превышает выход по примеру 1, а расход детергента увеличен.

П р и м е р 5. Аналогичен примеру 2, за исключением того, что количество воды 99,5 г, количество твердой части 38 г, соотношение детергент: сырье - 2: 1, а количество буферного раствора 190 г. Выход препарата составляет 95 мг. Способ по данным режимам не рекомендуется из-за большого расхода воды.

П р и м е р 6. Аналогичен примеру 2 за исключением того, что воды 24,75 г, количество твердой части 45 г, соотношение детергент: сырье 0,5: 1,0, а количество буферного раствора 270 г. Выход препарата 78 мг. Способ по данным режимам не рекомендуется из-за низкого выхода препарата.

П р и м е р 7. Аналогичен примеру 2, за исключением того, что время фракционирования составляет 0,7 ч. Выход составляет 105 мг. Способ по данным режимам не рекомендуется из-за увеличения времени обработки на 40% .

П р и м е р 8. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что фракционирование проводят в течение 0,4 ч. Выход составляет 60 мг. Способ по данным режимам не рекомендуется из-за низкого выхода.

П р и м е р 9. Аналогичен примеру 1 за исключением того, что в качестве детергента используют сульфирол-8 в концентрации 1,5% . Выход препарата 113 мг, активность 196 ед/г.

П р и м е р 10. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что детергентом служит пенообразователь N 2. Выход препарата 100 мг, активность 203 ед/г.

П р и м е р 11. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что детергентом является алкилсульфат-паста. Выход препарата 106 мг. , активность - 193 ед/г.

П р и м е р 12. Аналогичен примеру 1, за исключением того, что в качестве сырья используют пилорические придатки рыб. Выход фермента 97 мг, активность - 198 ед/г. (56) 1. Bicsak T. A. Harpev E. J Biolchem, 1984, v. 259, N 21.

2. Peterkofsky B. Methodes Enzymol. , 1982, v. 82, р. 453-471.

3. Патент СССР N 1688789, кл. С 12 N 9/48, 1991.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОЛЛАГЕНАЗЫ, предусматривающий фракционирование панкреатосодержащего органа гидробионтов, отделение твердой части, концентрирование, очистку и сушку, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода целевого продукта и снижения его себестоимости, фракционирование осуществляют водным раствором ионного детергента с концентрацией 0,5 - 1,5 об. % при соотношении с сырьем 0,8 : 1 - 1 : 2.