Способ определения протеолитической активности в верхних отделах пищеварительного тракта посредством субстратной цепочки

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии. Задачей изобретения является разработка способа раздельного определения пепсинового и триптазного протеолиза в пределах гастродуоденальной области. Для решения поставленной задачи формируется двухканальная субстратная цепочка, первый канал которой заполняют белком, высокочувствительным к действию панкреатических протеиназ, а второй канал, наоборот, высокочувствительным к действию панкреатических протеиназ и малочувствительным к действию пепсинов, при этом отношение гидролиза белка в первом канале к гидролизу белка во втором, превышающее единицу, свидетельствует о преобладании пепсинового протеолиза, а ниже единицы - триптазного. 6 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии. Известны электрометрические способы определения протеолитической активности в теле желудка и двенадцатиперстной кишки (Карандашова Г.Ф. Определение интрагастральной протеолитической активности электрометрическим способом. Дисс. канд., Л., 1976). Основным их недостатком является высокая стоимость измерительной аппаратуры. Кроме того, с их использованием невозможно проводить исследования в естественных условиях пищеварения, так как применяемая аппаратура и датчики на это не рассчитаны.

Известен также простой и дешевый способ определения протеолитической активности в верхних отделах пищеварительного тракта in vitro (Авторское свидетельство N 1425551), выбранный нами в качестве прототипа по наиболее близкой технической сущности. Данный способ позволяет проводить одновременное определение кислотности и протеолитической активности в естественных условиях пищеварения.

Способ осуществляется следующим образом.

Утром натощак больному трансназально вводится в желудок субстратная цепочка - серия сегментов прозрачной поливинилхлоридной трубки, заполненных чувствительным к протеиназам субстратом, закрепленная на тонкой капроновой нити. В качестве субстрата используется раствор яичного белка в 4 М мочевине, коагулированный нагреванием. По длиннику субстратной цепочки имеются отстоящие на 40 мм друг от друга оконца, предназначенные для контакта содержимого желудка с субстратом. Цепочка вводится таким расчетом, чтобы ее проксимальный отдел находился в кардиальном отделе желудка, это достигается подбором длины фиксирующей нити. Длину нити следует брать равной произведению P · 0,28, где P - рост в см, 0,28 - эмпирически найденный коэффициент. После введения субстратной цепочки и закрепления наружного конца зонда с помощью лейкопластыря к верхней губе и ушной раковине пациента, больной в течение суток ведет обычный образ жизни и обязательно принимает пищу в положенное время. По истечение суток цепочку извлекают, определяют в предлежащих к каждому оконцу сегментах длину переваренного участка субстрата, на основании чего в каждом сегменте рассчитывается средняя протеолитическая активность, выраженная в г/м² за 24 часа. Кроме того определяют протяженность диффузии в субстрате ионов водорода. С этой целью измеряют в мм расстояние от края оконца до зоны обратимой коагуляции белка в субстрате - l 30K. На основании полученной величины по калибровочной кривой определяют среднесуточную концентрацию ионов водорода в сегментах цепочки. Кислотность выражается в ммоль/л.

Проведенные с использованием данного способа исследования показали, что протеолитическая активность в желудке и главным образом в его антральном отделе не всегда коррелирует с функционально-морфологическим состоянием главных желез желудка, вырабатывающих HCl и пепсины. Как было показано Жигаловой Т.Н. (Клинические аспекты изучения кислотно-протеолитической активности в желудке при хроническом гастрите. Дисс. канд., Л., 1991) и Мировской М. О. (Регионарная кислотно-протеолитическая активность желудка при язвенной болезни в ночное время и влияние на нее дигестивных и фармакологических факторов. Дисс. канд., С.-Петербург, 1992), высокая протеолитическая активность в дистальных отделах желудка может наблюдаться у больных с полной атрофией фундальных желез или на фоне индуцированной H₂-блокаторами ахлоргидрии. Эти данные свидетельствуют о гетерогенности протеолиза в желудке. Судя по всему интенсивность протеолиза определяется не только пепсинами при подходящих условиях pH интрагастральной среды, но и протеиназами поджелудочной железы, попадающими в желудок из дуоденум в ходе пищеварения.

Для выяснения роли пищеварительных протеиназ в патофизиологии желудка и двенадцатиперстной кишки необходимо было разработать способ раздельного определения их активности. Эта задача оказалась не решаемой при использовании в качестве субстрата обработанного мочевиной яичного белка, ибо последний одинаково хорошо переваривается как пепсинами, так и ферментами поджелудочной железы: трипсином и химотрипсином.

Задача изобретения - разработка способа раздельного определения пепсинового и триптазного протеолиза в пределах гастродуоденальной области. Указанная задача решается тем, что в ходе исследования формируется двухканальная субстратная цепочка, первый канал которой заполняется белком, высокочувствительным к действию пепсинов и малочувствительным к действию панкреатических протеиназ, а второй канал, наоборот, высокочувствительным к действию панкреатических протеиназ и малочувствительным к действию пепсинов, при этом отношение гидролиза белка в первом канале к гидролизу белка во втором, превышающее единицу, свидетельствует о преобладании пенсинового протеолиза, а ниже единицы - триптазного.

Способ осуществляется следующим образом.

На приготовление субстрата для определения преимущественно пепсинового протеолиза используется белок куриного яйца, который после фильтрования через 2 слоя марли набирается в первый канал субстратной трубки. Для определения триптазного протеолиза используется то же яичный белок, но обработанный мочевиной и цепорином.

С этой целью при постоянном помешивании на магнитной мешалке к сырому яичному белку добавляется мочевина из расчета 240 мг/мл и затем через 30 минут цепорин из расчета 50 мг/мл. Приготовленный субстрат набирается во второй канал субстратной трубки. Затем субстратная трубка заливается кипятком и субстрат подвергают термической обработке - денатурации. Перед исследованием по ходу субстратной трубки лезвием безопасной бритвы делаются оконца длиной 5 мм, равноотстоящие друг от друга на 40 мм. Оставшийся в оконцах субстрат удаляется с помощью лопаточки. На проксимальный конец субстратной цепочки крепится капроновая нить, на дистальный - направляющая слива. Цепочка вводится трансназально таким же образом, как и в прототипе. Исследование проводится в естественных условиях питания пациента в продолжение суток. По извлечении цепочки измеряется в мм количество переваренного белка в прилежащих к каждому оконцу сегментах трубки, т.е. для первого и второго канала соответственно. Результаты протеолитической активности выражаются в граммах переваренного белка на единицу поверхности субстрата. Так же мы измеряем в цепориновом субстрате протяженность диффузии ионов водорода в субстрат l 30K. Кислотность выражается в ммоль/л, она рассчитывается по калибровочной кривой и соответствует величине 30K при 24-часовом исследовании. В заключение оценивается отношение гидролиза белка в первом канале к гидролизу белка во втором канале. При этом если данное соотношение превышает единицу, то это свидетельствует о преобладании пепсинового протеолиза, а ниже - триптазного.

В проведенных опытах in vivo в желудочном соке и дуоденальном содержимом было обосновано применение цепорина в указанной дозировке, как вещества, способного тормозить пепсиновый и активизированный триптазный протеолиз.

В табл. 1 отражены результаты гидролиза яичного белка в субстратных трубках при его инкубации в желудочном и дуоденальном содержимом. Использовался обычный яичный белок, белок, обработанный мочевиной без и с добавлением в возрастающей концепции цепорина. Время инкубации 20 часов. Видно, что яичный белок в желудочном соке переваривается в 3 раза интенсивнее, чем в дуоденальном содержимом. Обработка белка мочевиной не влияет на его гидролизуемость в желудочном соке, но почти в 3 раза увеличивает скорость переваривания в дуоденальном содержимом. Добавление цепорина приводит к зависимому от дозы торможению скорости переваривания в желудочном соке и увеличению скорости переваривания в дуоденальном содержимом. При дозе цепорина 50 мг/мл белка семикратное подавление протеолиза в желудочном соке с одновременной активизацией его на 73% в диоденальном содержимом. Поскольку дальнейшее увеличение цепорина активизирует протеолиз в дуоденальном содержимом незначительно - доза цепорина 50 мг/мл выбрана как наиболее отвечающая поставленной задаче.

В табл. 2 приведены сравнительные данные по перевариванию обычного и обработанного цепорином белка в желудочном и дуоденальном содержимом. Как видно из приведенных данных, обычный белок, денатурированный нагреванием, в желудочном соке переваривается в 4,5 раза быстрее, а в дуоденальном содержимом в 5,6 раза медленнее, чем обработанный мочевиной и цепорином.

В целях приближения к реальным условиям, в которых желудочное и дуоденальное содержимое могут перемешиваться, например, при выходе желудочного содержимого в дуоденум и забросе дуоденального содержимого в желудок, гидролизуемость обоих субстратов была исследована в смеси дуоденального и желудочного содержимого.

В табл. 3 видно, что по мере добавления дуоденального содержимого и снижения кислотности среды, скорость гидролиза обычного белка резко падает, а обработанного цепорином сначала снижается, а затем, при нейтральных и слабощелочных значениях pH возрастает, достигая максимальных значений в чистом дуоденальном содержимом. Существенно, что при кислых значениях pH среды абсолютно преобладает протеолиз обычного белка, а при нейтральных и щелочных - белка, обработанного мочевиной и цепорином.

Приведенные данные обосновывают возможность использования испытанных субстратов для раздельного определения пепсинового и триптазного протеолизов в верхних отделах пищеварительного тракта.

Пример 1. Больной А., 30 лет. История болезни N 15206 за 1994 год. Диагноз: язвенная болезнь, язва луковицы двенадцатиперстной кишки. Рост больного 176 см. Расстояние от крыла носа до кардии равно 176 · 0,28 = 49 см. Цепочка введена на глубину 45 см с тем, чтобы проксимальное оконце расположилось в кардиальном отделе пищевода. Субстрат (как и в последующих примерах) - яичный белок и белок, обработанный мочевиной и цепорином. Длина сегментов 45 мм. В продолжение исследования больной вел обычный образ жизни, лекарств не принимал. В табл. 4 представлены полученные результаты, записанные от проксимального к дистальному концу цепочки.

Как видно, у больного на фоне высокой кислотности на большом протяжении желудка абсолютно преобладает пепсиновый протеолиз, т.е. отношение гидролиза яичного белка к гидролизу белка, обработанного цепорином, значительно превышает единицу.

Пример 2. Больной К., 59 лет. История болезни N 1010 за 1995 год. Диагноз: хронический атрофический гастрит B₁₂ дефицитная анемия. В течение суток (с 18.01.95 по 19.01.95) проведено исследование кислотно-протеолитической активности. Результаты представлены в табл. 5.

В данном наблюдении на фоне ахлоргидрии пепсиновый протеолиз преобладает лишь в самых верхних отделах желудка на небольшом протяжении (первые два сегмента). В остальных отделах расщепление белка осуществляется протеиназами поджелудочной железы, на что указывает низкий коэффициент отношения Пр п / ПР т.

Пример 3. Больной Д., 52 года. История болезни N 21587 за 1994 год. Диагноз: Желчно-каменная болезнь. Хронический гастрит с секреторной недостаточностью. При обследовании - эндоскопические признаки гастрита, что подтверждается данными гастробиопсии. При исследовании кислотно-протеолитической активности с помощью двойной субстратной цепочки в течение суток получены данные, указанные в табл. 6.

При невысоких показателях кислотности в желудке, в проксимальных отделах белок расщепляется преимущественно пепсинами, а в дистальном - протеинозами поджелудочной железы.

С целью проверки способа было проведено исследование кислотно-протеолитической активности в желудке с использованием двойной субстратной цепочки у 38 больных, 12 из которых страдали язвенной болезнью луковицы двенадцатиперстной кишки, 16 - хроническим атрофическим пангастритом и 10 человек - хроническим гастритом с умеренной атрофией слизистой оболочки желудка. Во всех случаях оценивалось соотношение гидролиза яичного белка к гидролизу белка, обработанного мочевиной и цепорином. В тех случаях, где соотношение превышало единицу, преобладал пепсиновый протеолиз, а ниже единицы - триптазный.

Таким образом, представленные данные о результатах исследования протеолитической активности в желудке с субстратами, селективно реагирующими на кислые протеиназы желудка и щелочные протеиназы поджелудочной железы, свидетельствуют о возможности дифференцированной оценке природы протеолитической активности в гастродуэденальной области в естественных условиях пищеварения.

В этом заключается преимущество заявленного способа перед прототипом. Благодаря использованию селективных субстратов представляется возможность раздельной оценки природы протеолиза у больных с гастродуоденальной патологией. Благодаря этому открываются новые возможности для оценки роли пищеварительных протеиназ в патофизиологии желудка, пищевода и двенадцатиперстной кишки и суждении о фармакодинамике антацидных и антипептических лекарственных средств, применяемых в лечении так называемых пептических заболеваний, в частности - язвенной болезни.

Показания к применению предлагаемого способа в клинике: а) В диагностике пищеварительной недостаточности желудка и оценке эффективности применяемых с целью ее коррекции лекарственных средств.

б) В определении уровня и природы кислотно-протеолитической агрессии в желудке при язвенной болезни и оценке антипепсиновой эффективности антацидов, антипептиков, ингибиторов желудочной секреции.

в) В оценке эффективности оперативных вмешательств на желудке, направленных на подавление кислотно-пептической агрессии.

Формула изобретения

Способ определения протеолитической активности в верхних отделах пищеварительного тракта посредством субстратной цепочки, отличающейся тем, что формируют двухканальную субстратную цепочку, первый канал которой заполняют белком, высокочувствительным к действию пепсинов и малочувствительным к действию панкреатических протеиназ, а второй канал, наоборот, высокочувствительным к действию панкреатических протеиназ и малочувствительным к действию пепсина, при этом отношение гидролиза белка в первом канале к гидролизу белка во втором, превышающее единицу, свидетельствует о преобладании пепсинового протеолиза, а ниже единицы - триптазного.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2