Противоопухолевая композиция

 

Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, Цель изобретения - придание композиции противовирусного и иммуномодулирующего свойств. Противоопухолевая композиция содержит днРНК и а -интерферон или интерлейкин-2 в определенных соотношениях. Изобретение позволяет улучшить лечение рака, вирусных инфекций и иммунорегуляторных расстройств у человека.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s A 61 К 37/66

) ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

1ВЕДОМСТВО СССР

i(ГОСПАТЕНТ СССР) в

ИЗОБРЕТЕНИЯ °

l ОП И САН И Е К ПАТЕНТУ р ки (21) 4355416/14 (22) 03.03,88 (46) 23.08.93. Бюл. М 31 (31) 021368 (32) 03.03.87 (33) US (71) Хем Рисерч, Инк, (US)

i 721 Вилльям А.Картер (US) (56) Joyrnal of Medicine, v. 313, 1485, 1985. (54) .ПРОТИНООПУХОЛЕВАЯ КОМПОЗИЦИЯ

Изобретение относится к медицине, а

; именно к фармакологии.

Целью изобретения является придание ! композиции противовирусного и иммуномо,дулирующего свойств.

Применение лимфоки нов сдерживается ввиду узкой области терапевтического ис, пользования и значительной токсичности, которая наблюдается при высоких дозах, 1 необходимых для того, чтобы вызвать реак июю в раковой опухоли человека или при вирусных заболеваниях. Существует синергетическая связь между лимфокинами и

1 дн РНК, которая значительно снижает необ, ходимые дозы лимфокинов, в частности 11= 2, и одновременно расширяет их область

1терапевтического применения. Специаль ныее комбинации днРНК плюс 1L — 2 при ле1 чении раковых, вирусных и воспалительных заболеваний существенно увеличивают

1, процент выживания животных, носителей меланомы человека.

Лимфокины получают при помощи тех нологии рекомбинантной ДН К. Термин 1L-2

„„Я „„1836103 АЗ (57) Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, Цель изобретения — придание композиции противовирусного и иммуномодулирующего свойств. Противоопухолевая композиция содержит днРНК и а -интерферон или интерлейкин-2 в определенных соотношениях, Изобретение позволяет улучшить лечение рака, вирусных инфекций и иммунорегуляторных расстройств у человека, относится к клеткам -убийцам, активированным рекомбинантными лимфокинами. Последние продуцируются в лабораторных условиях при воздействии на кровяные клетки человека (полученные лейкаферезом) при помощи 1L — 2. Затем эти клетки снова

° аааЪ вводят пациенту, где АК-клетки при продолжении стимулирования 1L — 2 будут убивать CO или регулировать опухоль пациента. (h)

Наиболее чувствительными опухолями О являются опухоли почек и меланома, при ъ этом настоящее изобретение имеет широ- С) кукк область применения при других видах лаь рака, вирусных расстройствах и различных воспалительных состояниях.

Синергетическая комбинацию днРНК в (ду качестве нетоксичного элемента и лимфоки- на в качестве токсичного элемента значительно снижает необходимые дозы лимфокинов, особенно 1L — 2, до умеренных, нетоксичных доэ и одновременно расширяет область их терапевтического применения. Синергетическая комбинация,в частности, интерферона или различных ин1836! 03 терлейкинов, таких как 1L — 2 в качестве компонента лимфокина, является эффективным средством для регулирования развития опухоли человека, в частности рака легких и почек и злокачественной меланомы, или при других расстройствах.

Композиция, являющаяся предметом изобретения, представляет собой днРНК и интерлейкин, применяемые одновременно или последовательно, концентрации которых приводят к увеличению содержания как

К-, так и АК-клеток в организме без увеличения токсичности. Одновременно с использованием вышеупомянутой дн РН К/лимфокин-терапией, настоящее изобретение включаеттакжеприменение материала, который ингибирует активатор циклооксигеназы, В качестве примера настоящее изобретение включает одновременное применение индометацина, ингибитора простагландина, при этом высвобождается "управляющий" простагландин и полученная в результате К-клетка снижает реакцию регулирования, Таким образом, естественные ингибиторы искомых К-клеток уничтожаются и популяция К-клеток соответственно увеличивается.

Количество компонентов комбинации варьируется в соответствии с клиническими наблюдениями и результатами терапии. Общие количества днРНК дают пиковую концентрацию в крови 0,1 — 1000 мкг днРНК на

1 мл в системном кровообращении сразу же после применения. измеренную в точке, удаленной от места вливания, Если лимфокином является интерферон, в предпочтительном варианте а- интерферон, то обеспечивается количество 0.01 — 100000

ИРЕд на 1 мл жидкости организма пациента. Когда лимфокином является 1L-2, то применяемое количество лежит в области. от примерно 10 1L — 2 единиц на 1 кг массы

2 пациента до значения, приближающегося к неприемлемым уровням токсичности, которое. может быть очень высоким, например

10 единиц. Самые эффективные, с приемлемыми значениями токсичной реакции, величины лежат в области примерно 10 — 10

3 4

1L-2 единиц на 1 кг массы тела.

Исследования нэ живых организмах и в лаборатории подтверждают, что днРНК (и плохо сочетаем ые дн P Н К, в частности) обладают синергетическим фармакологическим действием в общем случае. с интерлейкином (в частности, с 1L — 2), которые приводят к усиленной биологической реакции (противоопухолевой, противовирусной, иммуномодуляторной) с значительно более низкой токсичностью. Доза 1L 2, необходимая, например, для противоопухолевой реакции, может быть уменьшена в 30-100 раз. Синергетический фармакологический эффект подтверждается как на уровне К (натураль5 ных убийц)-чувствительных, так и на уровне

К-стойких опухолевых или инфицированных вирусов клеток; К-стойкие опухолевые или инфицированные вирусом клетки вызываются также LAK (активированными лимфокином убийцами)-клетками. Эта активность совершенно однозначна с использованием в качестве маркеров моноклональных антител, в которых наблюдается значительное увеличение одновременно как К-клеток (с

15 использованием моноклонального антитела азиало-Gml), так и LAK-клеток (с использованием моноклонального антитела Thy 1, 2).

Эти антитела являются легкодоступными реагентами моноклональных антител, Одновременное использова чие соединений,ко25

55 торые уменьшают биологический уровень различных естественных антагонистов Кклеток (таких, как простагландин), еще более улучшает синергетический эффект.

ДнРНК действуют как биохимические катализаторы, увеличивая селективное уничтожение клеток опухолей применяемых

1L — 2, продуцируемым LAK-клетками, без токсического действия. Этот факт установлен при проведении исследований на культурах клеток, Линию клеток рака почек человека, обозначаемую через.7860, выращивают в стандартных чашках Петри и подвергают воздействию различных потенциальных клеток-убийц, Периферийные клетки крови, полученные от здорового человека, именуют клетками-эффекторами (клетками-убийцами), а клетки рака почек— клетками-жертвами. Степень уничтожения последних (именуемая цитотоксичностью) измеряют различными методами, включая использование сверхжизнеспособных штаммов или радиоизотопов, Погибшие клетки опухоли высвобо>кдают ранее поглощенные радиоактивные метаболические предшествующие соединения и не могут далее поглощать внеклеточные питательные вещества. Например, амплиген, плохо сочетаемая днРНК, увеличивает активность человеческих LAK-клеток (полученных иэ крови здорового человека) значительно больше, чем с использованием только 1L-2, При концентрации 1L-2 в 1000 единиц на 1 мл уже достигается максимальная гибель клеток, и невозможно ее поднять еще больше при помощи днРНК. Катализатор, днРНК, в этой системе, если он используется один, плотностью инертен. Следовательно, воздействие на клетки опухоли не является результатом простого арифметического

1836103

45 ма днРНК (500 мкг дважды в неделю) в ко бинации приводит и дальнейшему увели ению ингибирования опухоли (р < 0,02).

В ным фактором является то, что комбина ии лимфокина (днРНК) не вызывали об- 50 на уживаемой токсичности у животных.

:. Преимущества терапевтического синергизма на уровне человека., :Терапия с использованием комбинаци, являющейся предметом изобретения, 55 снижает токсичность лимфокинов в общем случае и 1L — 2 в частности в клинической медицине. 1L 42 является э фективным при низких дозах только 10 — 10 единиц на 1 кг, э если его используют в комбинации сднРНК, суммирования 2 маргинально активных агентов.

В отдельных экспериментах также показано, что днРНК (плохо сочетаемая д РНК) не заставляет лимфоциты продуцир вать 1L — 2. ДнРНК может работать в систе е лимфокин 1L — 2 при помощи различных д угих средств, включая изменение плотносТ некоторых антигенов на клетках-жертв х таким образом, что эффективность д йствия клеток-убийц возрастает. Кроме то о, днРНК и 1L — 2 вместе могут изменять э фекты после гибели клеток, например ув личение связывания клеток эффекторов>х ртв или увеличение продуцирования разл чных цитотоксичных факторов, или увеличение циркуляции клеток-убийц от однс и клетки-жертвы опухоли к другой клеткеж ртве опухоли.

Исследования на животных показывают бд ее высокую выживаемость и уменьшен е скорости распространения опухоли, О ухоль меланомы человека, именуемая

P", вводят в подушечку лапки мышей неск льких групп. Мыши не могут отторгнуть ка чужеродную человеческую опухоль. У необработанных мышей клетки опухоли быст о размножаются, распространяются в ле кие, и животные погибают. Обработанньм мышам вводят дозы в 10 — 10 едиз н ц/кг 1L-2 (примерно 2500 единиц на м шь) и днРНК (500 мкг), что эквивалентно примерно 100 — 300 мг для пациента массой

60 кг. Оба биологических препарата дают дв раза в неделю, Показано . значительное снижение метастазов в легких животных, обработанных днРНК плюс IL — 2, что очевидно является

j неожиданным по сравнению с результатам полученными при применении двух этих аг нтов отдельно. Такое уменьшение метаст ов в легких коррелирует с увеличением вь ивания. Аналогичные результаты получ ны для интерферона (альфа) 2000 ЕИР (е иниц интерферона), когда плохо сочетае5

35 в то время как при использовании без днРНК он совсем неэффективен при таких безопасных дозах.

При вирусных расстройствах могут быть получены аналогичные терапевтические преимущества. Например, терапевтические вмешательства, которые воздействуют только на иммунные дефициты (чувствительны к 1L — 2) при HIV-инфекциях, оказывается, являются производящими обратный эффект, Считается, что клетки-помощники Т4 с

ТАС-рецепторами чувствительны к лимфокину 1L — 2, но в жертвах вируса СПИД вЂ” 1L — 2 вызывают размножение клеток, которые являются непосредственно уязвимыми для

НИ-инфекции, и в результате наблюдается ухудшение состояния пациента. При помощи добавления дн РН К и 1L — 2 можно добиться расширения и улучшения спектра 1L — 2 и, потенциально, других лимфокинов, таких как интерферон и ТНФ, в качестве полезных противовирусных агентов, Плохо сочетаемая двунитевая РНК является известной формой макромолекулярной

РНК, в которой дестабилизация двойной спирали предотвращает спаривание оснований. Плохо сочетаемая днРНК является хорошо известной благодаря ее свойствам индуцирования интерферона, что указывает на механизм, не связанный с самой индукцией интерферона.

Общим терапевтическим осуществлением плохо сочетаемой двунитевой РНК является синтетическая днРНК, образованная при помощи формирования комплексов полирибонинозиновой и полирибоцитидиловой уридиловой кислоты, такой как г/пг/Сх, Ч или 6/и, где х — принимает значение от 4 до 29, например r/n г(СиЧ)г (амплиген). Основное терапевтическое преимущество плохо сочетаемых днРНК над другими формами натуральной и/или синтетической днРНК заключается в их более низкой токсичности для животных и человека. Далее ранние комплексы днРНК способны возбуждать различные, связанные с интерфероном, эффекты, но токсичность таких соединений мешает какому-либо клиническому применению при лечении рака или связанных с ним расстройств, Под "плохо сочетаемой днРНК" подразумевают ту РНК, в которой водородная связь (связывающая основания) между составляющими нитями является относительно неповрежденной, т.е. прерывается в среднем меньше, чем на одну пару оснований на каждые 29 последовательных остатков оснований. Термин "плохосочетаемая

1836103 днРНК" необходимо понимать соответствующим образом.

ДнРНК может быть комплексом полиинозината и полицитидилата, содержащим долю урациловых оснований или гуанидиновых оснований, например, от 1 в 5 до 1 в 30 таких оснований (поли 1, поли C4 — 29 х > V или G). Плохо сочетаемой днРН К может быть поли 1,поли С, V, в котором отношение С и

V составляет примерно 13 и 1, а коэффициенты отложения поли! и поли С, V оба меньше 9 и содержатся внутри единиц друг от друга, т,е. в предпочтительном варианте от

6,5 примерно до 7,5.

ДнPH К может иметь общую формулу г/и (С12-13V)A Другие подходящие примеры днРНК описаны ниже.

710 -710 ME

Составитель Е. Лебедева ж Техред М,Моргентал Корректор Л. Пилипенко

Редактор

Заказ 2992 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Плохо сочетаемые днРНК,, используемые в предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения, основаны на сополинуклеотидах, выбранных из поли (Cn, V) и поли (Сл, 6), в которых n — целым числом от 4 до 29, и являются плохосочетаемыми аналогами. комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидиновой кислот, образованных при помощи модификации r/n rCn с целью присоединения непарных оснований (урацила или гуанина) вдоль нити полирибоцитидилата (rCn). В качестве альтернативы днРНК можно получить из пали (1). поли. (С) днРНК при помощи модификации рибозиловой основы полирибоинозиновой кислоты (r/n), например, при помощи включения 2-0 — метил рибозиловых остатков. Из этих плохо сочетаемых аналогов r/и rCn предпочтительными являются те, которые имеют общую формулу r/n г(С12 ч ) .

Специальными примерами плохо сочетаемойднРНКдля использования всоответствии с настоящим изобретением являются:

5 поли(1) .Поли(С4, V), пали(1) пали(С7, V), поли(!) поли(С13, V), поли(!) пали(С22, V), поли(!} поли(С2о, G), 10 поли(!) поли(С29, 6) и поли(1} поли(Ср/23 G > р).

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением включает днРНК, в предпочтительном варианте

15 плохо сочетаемую, лимфокин и, необязательно, соединение, которое ингибирует активатор циклооксигеназы, в качестве активных компонентов вместе с фармацевтическим носителем или разбавителем.

20 Использование изобретения позволит улучшить лечение рака, вирусных инфекций и иммунорегуляторных расстройств у человека.

Формула изобретения

25 Противоопухолевая композиция, содержащая лифокин, в частности, интерлейкин2, отличающаяся тем, что, с целью придания ей противовирусного и иммуномодулирующего свойств, она дополнитель30 но содержит днРНК формулы r/nr(C12 V)n, а в качестве лимфокина содержит й-интерферон или интерлейкин-2 при следующем количественном соотношении компоненТОВ, мг

35 ДнРНК формулы г и r(C 12-V}

9 9

0,6-0,63; а-интерферон 60-6. f0 -6,3 10 ME или

Интерлейкин-2