Способ получения препарата иммобилизованной протеазы bacillus subtilis

 

СО1ОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИЛЛИСТИЧЕСКИХ РЕСП ВЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ав SU pl> 686 ЖЮ

{51) С12ИИ И А61К 7 48

1. (21) 02528785/04 (22) 05.09.77 (46) 1512Ю Боя. Йя 45-46 (71) Слециальиое конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ; Институт цитологии и генетики CO AH СССР (72) Аветисов ПА; Загребельный С.Н„Земцова Л3„

Кузмарева ТИ; Сглганик P.È„Ñòàðîñòèíà В,К (73) НМКТИ БАВ НПО "Вектор" (54) СИОССБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ИММОБИПИЗОВАННОЙ и РОТЕАЗЫ ВАСЫМ$

SU8TtUS (57) 686377

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и, в частности, к способам получения иммобилиэованных ферментных препаратов, а именно к способу получения препарата иммобилиэованной протеазы 5

„BaclI! us sub till s, Препарат иммобилизованной протеазы

Bacillus subtll может быть использован s медицийе для лечения гнойных абсцессов и ран,. в,.биохимии для гидролиэа белков в 10 . лабораторных",целях, а также в промышленности для гидролиза белковых смесей.

В литературе описан ряд способов получения иммобилизованных протеаз BBCIIIus

subtllls.,з 15

Известен способ получения препарата иммобилизованной субтилопептидаэы А

Вас. subtills на пара-аминобензилцеллюлозе, который включает две стадии: актива=. цию матрицы путем диазотирования и 20 иммобилизацию фермента на активированной матрице.

Недостатком способа является низкая протеолитическая активность и репаратов— менее 10Я, от исходной. 25

Известен также способ получения препарата иммобилиэованной протеазы Вас.

subtllls на силохроме С-ЯО, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида с последующей 30 иммобилизацией фермента. Источником протеаэы служит раствор протосубтилина Г

10 Х, представляющий собой сложную смесь белков, включающую фермент протеазу, полученную после осаждения балласт- 35 ных белков из культуральной жидкости

Bacillus зоЫИз ацетоном, центрифугирования и сублимационной сушки супернатанта.

Способ получения препаратов иммобилиэованной протеазы заключается в следую- 40 щем. Силохром С-80 обрабатывают аминопропилэтоксисиланом, а затем глутаровым альдегидом. К влажному активированному носителю добавляют 30 -ный раствор протосубтилина Г10Х в количестве 45

27-30 ед.flC/MÃ */ носителя, (3a единицу

ПС принимается такое количество фермента. которое в течение 1 ч при 38 С катализирует гидролиэ казвина в такой степени, что способность его связывать HCI падает на 50 величину, эквивалентную 1 мл 0,1 н раствора NaOH). Процесс иммобилизации осуществляют при перемешивании на ледяной бане при рН 7.4-7.5, После чего препарат отделяют на пористом фильтре от жидкости.

Иммобилиэованный препарат промывают до исчезновения следов белка в промывных водах. Процент сохранения активности препаратов составляет 12.9- 14,ь.

Недостатком этого способа является низкий процент сохранения активности и ограниченность применения. Так. например, получаемый препарат невозможно использовать вмедицине.

Целью описанного способа является устранение недостатков известного способа, а именно. увеличение процента сохранения активности протеаэы при иммобилизации, Указанная цель достигается за счет того, что в качестве матрицы для иммобилизации про вазы используют аминоэтилцеллюлозу (AE-целлюлозу), а активацию матрицы проводят в 0,1-1М фосфатном буфере при рН

6-9 в течение не менее 2 ч.

Согласно изобретению описывается способ получения препарата иммобилиэованной протеазы Вас. subtllis с высоким процентом сохранения активности, заключающийся в активации АЕ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1 — 1M фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее 2 ч с последующей иммобилиэацией фермента на активированном носителе.

Процесс проводят следующим образом.

В качестве аминоэтилцеллюлоэы (АЭцеллюлоза) используют препарат отечественного производства (завод химреактивов в г. Олайне) и фирмы "Реанал" (Венгрия).

Протеазу Вас. subtills берут в виде водного раствора.

В качестве источника протеаз используют протосубтилин ГЗХ, очищенный по методу, который заключается в осаждении балластных белков раствором CaCIz, удалении осажденных белков центрифугированием и осаждении протеаз из надосадочной жидкости этиловым спиртом. За единицу активности протеаз принимают такое количество фермента, которое переводит в кислоторастворимую фракцию 1 мг тирозина за 15 мин при 37 С.

Описываемый способ состоит из следующих стадий: — активиравание ЯЭ-целлюлозы глутаровым альдегидом в 0,1-1 M калий-фосфатном буфере при рН 6-9 в течение не менее

2 ч при комнатной температуре. при уменьшении времени активации снижается протеолитическая активность конечного продукта. — иммобилизация протеазы на активированной АЭ-целлюлозе при 4-5 С и перемешивании в 0,1 — 1 M растворе калий-фосфатного буферэ рН 7,3-7,7.

Вносят 40-50 ед. акт. фермента на 1 кг сухого веса активированной матрицы.

При уменьшении конценграции фосфорнокислых сопей в буфере п 1и активации й86377

Составитель Л.Аветисов

Техред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко

Редактор А,Колоскова

Заказ 3348

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-.издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 и иммобилизации снижается активность конечного продукта.

Полученные препараты иммобилизованной протеазы имеют активность 32-40 ед,акт,/г сух. и репа рата и сохранение активности составляет 17-30$ от исходной активности.

При гидролизе альбумина в проточной колонке с иммобилизованной протеазой сохраняется 100 активности в течение 4-х сут при 25 С. В течение 3-4 сут в гнойной ране также сохраняется 100 активности.

Преимуществом описываемого способа, по сравнению с прототипом, является использование активированной целлюлозной матрицы для иммобилизации протеазы.

В связи с этим получен высокий процент сохранения активности препарата иммобилизованной протеазы и высокая стабильность препаратов при гидролизе белков.

Приведенный ниже пример служит иллюстрацией описываемого способа.

Пример. 100 г влажной АЭ-целлюлозы (сухой вес 50 r) суспендируют в 230 мл 1 M калий-фосфатного буфера, рН 7,5: добавляют к полученной суспензии 75 мл 25 -ного водного раствора глутарового альдегида.

Смесь перемешивают в течение двух ч, Формула изобретения

СПОСОБ. ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА

ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ПРОТЕАЗЫ

- ВАС1Ш/3 ЯОВТ103, включающий активирование матрицы с помощью глутарового альдегида и последующую иммобилизацию протеазы, отличающийся тем, что, с целью фильтруют. Осадок на фильтое промывают водой 1 М водным раствором NaCI и вновь водой.

К активированной АЭ-целлюлозе при5 ливают 250 мл раствора, содержащего 1375 мг белка с удельной активностью 2 ед. акт/мг в 0,1 М калий-фосфатном буфере.

Смесь инкубируют при непрерывном перемешивании в течение 10-12 ч при 5 С, Пол10 ученный продукт отфильтровывают, промывают 1 M водным раствором NaCl до отсутствия оптической плотности в смывах, измеренной при 280 нм, и затем промывают водой; В результате получают 100 r иммоби15 лизованной протеазы с удельной активностью 32-40 ед. акт/г сухого веса с сохранением активности 17-30 от активности протосубтилина, взятого для иммобилизации при использовании казеина в

20 качестве субстрата. (56) Goldstein L. Nfater !пзо!иЫе enzymes

Biochemistry 9, 2322, 1970, Калашникова А.M. Термо- и рН-стабиль25 ность растворимой и иммобилизованной на силохроме С-80 протеазы Вас. subtllls. Прикладная биохимия и микробиология И(6) 842, 1975. увеличения процента сохранения активйо35 сти протеазы, в качестве матрицы используют аминоэтилцеллюлозу, а ее активацию проводят в 0,1 - 1 M фосфатном буфере при рН 6 - 9 в течение не менее 2 ч.